研究背景
在植物中miRNA是源自有發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈前體的內(nèi)源性小RNA。miRNA和其靶基因的進(jìn)化代表了一種動(dòng)態(tài)的基因表達(dá)通路，它們在決定植物不同器官發(fā)育中起基礎(chǔ)性的作用。本文利用高通量小RNA測序的手段研究了山茶花5個(gè)器官的miRNA空間表達(dá)譜。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

材料：Camellia
取樣組織：五個(gè)組織材料（幼嫩葉片、雄蕊、花瓣、心皮和花芽），三個(gè)生物學(xué)重復(fù)
測序策略：百邁客Illumina HiSeq? 2500 ，SE36
測序數(shù)據(jù)量：每個(gè)樣本測了18.9~28.2M的數(shù)據(jù)量

設(shè)計(jì)思路：

研究結(jié)果
1、山茶花5個(gè)組織保守miRNA分析和新miRNA鑒定
miRDeep2軟件鑒定175個(gè)潛在的miRNA。長度分布分析顯示21和22bp的miRNA豐度*高；對成熟miRNA的堿基偏好性分析：21和22bp的miRNA首位堿基偏好于“U”；23和24bp的miRNA首位堿基偏好于“A”。

miRNA長度分布

miRNA堿基偏好性

2、山茶花中MIR160家族的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析
將成熟的miRNA比對到植物的ncRNA Database鑒定到19個(gè)miRNA。以MIR160家族為例進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析：基于pre-miRNA序列來構(gòu)建MIR160家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示保守的c38436.graph_c0_79977與來自葡萄、楊樹、木薯和蓮花的MIR160形成了一個(gè)分枝，這也與山茶花的進(jìn)化地位相一致。

miRNA 160系統(tǒng)進(jìn)化樹

3、組織間miRNA差異表達(dá)分析

組間差異表達(dá)miRNA維恩圖

4、組織特異性miRNA鑒定
對不同組織miRNA表達(dá)情況繪制聚類熱圖，大部分miRNA在不同組織中特異表達(dá)。miRNA表達(dá)聚類熱圖顯示一些明顯有著不同表達(dá)模式的亞簇，在此主要關(guān)注了雄蕊和心皮所特異的2個(gè)亞簇。對雄蕊中特異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行GO注釋，顯著富集GO term為“DNA intergration ”和“氧化還原”。

miRNA表達(dá)量聚類熱圖及GO注釋

5、miRNA-靶基因的表達(dá)相關(guān)性驗(yàn)證
選取6個(gè)miRNA及其靶基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4對表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的關(guān)系。例如miRNA167靶向2個(gè)SPL基因，用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示出強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

miRNA及靶基因表達(dá)量相關(guān)性

6、山茶花中家系特異的miRNAs
(1).為了鑒定山茶花中家系特異miRNA家族，對不同植物中的miRNA家族構(gòu)建進(jìn)化樹。發(fā)現(xiàn)2個(gè)葡萄特異的miRNA家族出現(xiàn)在山茶花中，其中miR3633是高豐度和高識(shí)別度的，表明它出現(xiàn)在葡萄和山茶花分化之前。

miRNA家族進(jìn)化樹

(2).鑒定到12個(gè)山茶花家系特異miRNA，將其前體序列與NCBI中山茶花和葡萄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。在葡萄數(shù)據(jù)集里沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的miRNAs，但是大部分都出現(xiàn)在其他山茶花種里，說明這12個(gè)miRNAs是以家系特異的方式進(jìn)化的。

文章亮點(diǎn)

1：材料選擇；
山茶花是觀賞植物，因其在不同類型重瓣上產(chǎn)生額外的花瓣形成它獨(dú)特的觀賞價(jià)值。了解其花器官發(fā)育的分子機(jī)制有助于新品種的培育。

2：深度數(shù)據(jù)挖掘，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；
從組織特異性和發(fā)育調(diào)控方面，鑒定了組織特異性保守miRNA，深入進(jìn)行靶基因功能注釋富集分析揭示其參與器官形成的機(jī)制；重點(diǎn)關(guān)注控制花器官發(fā)育的miRNA-靶基因調(diào)控機(jī)制，并選擇一些關(guān)鍵miRNA-靶基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為miRNA-靶基因環(huán)狀調(diào)控方式提供了依據(jù)。

3：新的分析角度；
從進(jìn)化角度對山茶花屬的miRNA進(jìn)行了分析，描述了山茶花屬miRNA家系特異型的進(jìn)化方式。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

開花誘導(dǎo)在蘋果樹生命周期中發(fā)揮非常重要的作用，但是年輕的蘋果樹往往容易產(chǎn)生低質(zhì)量的數(shù)量少的花芽。嫩枝彎曲可以促進(jìn)產(chǎn)生較多的花芽，因此嫩枝彎曲成為蘋果樹一個(gè)非常重要的栽培性狀。樹嫩枝彎曲會(huì)產(chǎn)生一種新的長距離信號(hào)，從而改變樹的生長和發(fā)育。但是，響應(yīng)嫩枝彎曲發(fā)生的花芽生長和開花誘導(dǎo)的分子調(diào)控機(jī)制并不清楚，尤其是miRNA是否在其調(diào)控中發(fā)揮作用以及具體的機(jī)制如何。本研究關(guān)注在花芽發(fā)育、開花誘導(dǎo)和發(fā)育、響應(yīng)嫩枝彎曲過程中miRNA的潛在作用。

研究目的

解析蘋果樹響應(yīng)嫩枝彎曲時(shí)，植物激素和miRNA協(xié)同調(diào)控花芽生長和開花誘導(dǎo)的分子機(jī)制，有助于解決年輕蘋果樹低質(zhì)量花芽的問題。

材料方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：
生長六年大小的富士蘋果樹，分兩組進(jìn)行嫩枝彎曲（110度）、對照處理（垂直嫩枝），分別在開花誘導(dǎo)的初期（early stage，ES）、中期（Middle stage，MS）和晚期（Later stage，LS）取花芽，分別提取RNA進(jìn)行小RNA測序，6個(gè)花芽組織RNA混樣進(jìn)行降解組測序。
2.測序方法：
小RNA seq，Biomarker Illunima Hiseq 2000 platform

技術(shù)路線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 富士蘋果樹在開花誘導(dǎo)時(shí)期響應(yīng)嫩枝彎曲后的花芽生長
首先，研究富士蘋果樹在開花誘導(dǎo)時(shí)期，嫩枝彎曲處理后花芽生長情況。無論是對照還是嫩枝彎曲處理，從發(fā)育早期（ES）到晚期（LS），花芽的長度、寬度、干重都增加了。但是，嫩枝彎曲明顯增加了花芽的大小。此外，通過檢測花芽生長速率發(fā)現(xiàn)，花芽大小變化主要發(fā)生在花芽誘導(dǎo)的早期，即ES到MS時(shí)期；而且，在嫩枝彎曲處理下花芽生長速率明顯增加了。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，嫩枝處理組比對照組的開花速率明顯增大了。

2. 開花誘導(dǎo)時(shí)期花芽中激素含量的變化。
分別在開花誘導(dǎo)的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)（ES, MS, LS），對嫩枝彎曲處理組和對照組的花芽中激素（生長素，AUX；脫落酸，ABA；細(xì)胞分裂素，CK；赤霉素，GA）含量進(jìn)行檢測。分析了在嫩枝彎曲組合對照組，開花誘導(dǎo)過程中各種激素含量的變化。

3. 小RNA和降解組文庫構(gòu)建和測序。
為了研究嫩枝處理和對照組在ES、MS和LS時(shí)期小RNA的情況，構(gòu)建了6個(gè)miRNA文庫（CES, CMS, CLS, BES, BMS, BLS）并用Illunima Hiseq 2000進(jìn)行了測序?？偣搏@得了14 095 388, 14 106 904, 15 242 433, 13 259 311, 15 969 504 和13 523 103 raw reads。此外，對這六個(gè)組織提取的總RNA構(gòu)建了降解組文庫并進(jìn)行了測序，總共獲得了30 762 927 (93.08%) clean reads。分別對文庫進(jìn)行了插入片段大小分布的評估，對sRNA的長度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。

4. 已知miRNA的鑒定和表達(dá)模式分析。
為了鑒定蘋果中已知的miRNA，用BLASTN將這六個(gè)花芽的sRNAs比對到miRBase 18.0 和植物miRNA數(shù)據(jù)庫中?？偣搏@得了屬于41個(gè)miRNA家族的195個(gè)已知的miRNA。然后對已知miRNA的表達(dá)量進(jìn)行了分析。

Fig1. 差異表達(dá)已知miRNA維恩圖

對同一處理不同發(fā)育時(shí)期樣品間（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）篩選了差異表達(dá)miRNA并繪制了維恩圖。結(jié)果顯示，其中42個(gè)miRNA下調(diào)表達(dá)，20個(gè)miRNA上調(diào)表達(dá)。對不同處理相同發(fā)育時(shí)期樣品間（BES vs CES, BMS vs CMS and BLS vs CLS）篩選到124個(gè)差異表達(dá)miRNA，相對對照組，嫩枝彎曲處理組中68個(gè)下調(diào)表達(dá)，27個(gè)上調(diào)表達(dá)。

5. 新miRNA的鑒定和表達(dá)模式分析。
用栽培種蘋果（Malus domestica Borkh）作為參考基因組來預(yù)測潛在的新miRNA，共鑒定到137個(gè)新miRNA。對同一處理不同發(fā)育時(shí)期樣品間（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）新miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析并繪制了維恩圖。結(jié)果顯示，其中34個(gè)新miRNA隨著發(fā)育時(shí)期上調(diào)表達(dá)，24個(gè)新miRNA在嫩枝彎曲處理組表達(dá)高于對照組，23個(gè)新miRNA在對照組表達(dá)明顯高于嫩枝彎曲處理組。

對嫩枝彎曲處理組和對照組間的31個(gè)差異表達(dá)新miRNA進(jìn)行表達(dá)層次聚類分析。結(jié)果顯示，根據(jù)表達(dá)模式可分為5個(gè)亞簇。其中Cluster 1中的6個(gè)新miRNA在嫩枝彎曲組表達(dá)量均高于對照組。Cluster 5中的新miRNA表達(dá)模式則與Cluster 1中相反。其他三簇中的19個(gè)新miRNA，無論在對照組還是嫩枝彎曲處理組，展現(xiàn)出較低的表達(dá)水平。

Fig2. 差異表達(dá)新miRNA聚類熱圖

6. 已知和新miRNA的靶基因分析。
為了研究鑒定的已知和新miRNA參與的生物學(xué)過程，以及分析嫩枝彎曲調(diào)控開花誘導(dǎo)的分子機(jī)制，通過降解組來鑒定miRNA的靶基因。上文的分析顯示，在對照組和嫩枝彎曲組之間篩選到了41個(gè)家族195個(gè)已知miRNA。對這些已知miRNA以及它們目標(biāo)切割位點(diǎn)的具體分布信息進(jìn)行了分析。同時(shí)，鑒定了31個(gè)差異表達(dá)新miRNA的40個(gè)靶標(biāo)。

新miRNA調(diào)控的靶基因包括一些轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控蛋白。如，新m1736-3p的靶基因?yàn)榫幋a一個(gè)myb-like的HTH轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白（DUO1）。一些新miRNA調(diào)控的靶基因與植物激素相關(guān)，如新m1791-5p調(diào)控的靶基因?yàn)閰⑴cCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子CRF4。此外，一些新miRNA的靶基因參與糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝，如新miR1316-5p調(diào)控靶基因BGAL3。

7. 定量RT-PCR鑒定與AUC、ABA、控制開花相關(guān)的差異表達(dá)miRNA和靶基因
為了驗(yàn)證miRNA測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，以及分析在不同發(fā)育時(shí)期（ES-MS-LS）miRNA和靶基因的表達(dá)水平，我們檢測了在響應(yīng)嫩枝彎曲時(shí)與IAA、ABA、控制開花相關(guān)的miRNA和靶基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，與IAA、ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的miRNA和靶基因可能參與調(diào)控響應(yīng)嫩枝彎曲時(shí)蘋果花芽的形成。

創(chuàng)新點(diǎn)

1.蘋果樹嫩枝彎曲可以促進(jìn)產(chǎn)生較多的花芽，嫩枝彎曲是蘋果樹一個(gè)非常重要的栽培性狀，研究解析蘋果樹響應(yīng)嫩枝彎曲的分子機(jī)制，有助于解決年輕蘋果樹低質(zhì)量花芽的問題。
2.結(jié)合降解組的數(shù)據(jù)來分析鑒定miRNA的靶基因，更具有說服力。
3.分析了嫩枝彎曲誘導(dǎo)開花過程中激素含量的變化，并集合miRNA測序數(shù)據(jù)針對性地分析了激素相關(guān)基因的調(diào)控作用，深入解析了分子機(jī)制。
4.大量qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對miRNA和降解組測序數(shù)據(jù)的驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1] Libo Xing, Dong Zhang, Caiping Zhao, Youmei Li, Juanjuan Ma, Na An and Mingyu Han, (2015) Shoot bending promotes flower bud formation by miRNA-mediated regulation in apple (Malus domestica Borkh.) Plant Biotechnology Journal, pp. 749–770.

實(shí)驗(yàn)材料

大豆“Taiwan 75”培養(yǎng)在正常條件下，第一真葉期的幼苗分為對照組和處理組。對照組—25°C（12h），17°C（12h），處理組—4°C（24h）。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

研究結(jié)果

1.sRNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
首先，對大豆4°C處理組（3h、6h、9h、12h、24h和36h）及對照組進(jìn)行相對生長速率（RGR）和MDA含量的檢測。發(fā)現(xiàn)在24h時(shí)，對照組和處理組RGR和MDA含量明顯不同。因此，選擇冷脅迫24h進(jìn)行sRNA測序。

對照組和處理組分別獲得6559098和8273245 clean reads。長度為21nt所占比例*高（圖1A）。非冗余的reads，長度分布統(tǒng)計(jì)可以看出24nt所占比例*高，在對照組和處理組中分別為68.4%和59%（圖1B）。

圖1.sRNA長度分布圖

2.鑒定大豆中已知的miRNA
共鑒定到已知的434個(gè)miRNA，屬于133個(gè)家族。這些miRNA包括保守miRNA和種間特異性miRNA。保守miRNA在植物發(fā)育過程和響應(yīng)脅迫上起到重要作用。通過同源比對鑒定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156，miR160，miR164等在很多植物物種中都是高度保守的。此外，找到一些非保守miRNA，例如miR3522,表明他們可能參與大豆的物種進(jìn)化。

3.預(yù)測大豆中新的miRNA
根據(jù)miRNAs前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)來預(yù)測miRNAs，找到3個(gè)預(yù)測的miRNA并鑒定折疊成的二級結(jié)構(gòu)。

4.驗(yàn)證大豆中預(yù)測的miRNA
為了驗(yàn)證測序結(jié)果，利用qRT-PCR分析miRNA表達(dá)情況。選擇了35個(gè)miRNA（33個(gè)已知miRNA，2個(gè)預(yù)測miRNA）進(jìn)行qRT-PCR分析。線性回歸分析測序結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果相關(guān)性系數(shù)為0.8048，表明miRNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果相一致。盡管miRNA-Seq和qRT-PCR結(jié)果在√確的倍數(shù)方面有些差異，這可能是由于2種實(shí)驗(yàn)結(jié)果敏感性和特異性的不同導(dǎo)致的，但是miRNA表達(dá)趨勢是一致的。

圖2.qRT-PCR結(jié)果

5.miRNA靶基因鑒定
利用降解組測序鑒定miRNA降解的靶基因。共獲得12283683條raw reads，2623291條非冗余raw reads。共鑒定到898個(gè)轉(zhuǎn)錄本是54個(gè)miRNA家族的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以降解2個(gè)甚至更多的靶基因，與之前的研究相似。例如，gma-miRNAs可以沉默屬于SBP家族的15個(gè)基因，脫落酸響應(yīng)結(jié)合因素蛋白家族和2個(gè)基因，2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子等。而且，有7個(gè)轉(zhuǎn)錄本受到多個(gè)miRNAs的調(diào)控。

6.鑒定大豆冷脅迫下相關(guān)的miRNA
對miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，共鑒定到32個(gè)miRNA家族的51個(gè)miRNA差異表達(dá)。在冷脅迫下有30個(gè)下調(diào)表達(dá)，21個(gè)上調(diào)表達(dá)。

對相應(yīng)靶基因進(jìn)行功能注釋來研究差異表達(dá)的miRNA可能行使的功能。差異表達(dá)的miRNA可以分為四類。第一類包括miRNA家族（miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327），靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH，參與調(diào)控基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)。第二類包括miR4411，其對應(yīng)靶基因涉及抵御疾病。第三類包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416，其對應(yīng)靶基因參與植物生長發(fā)育中的適應(yīng)性。為了進(jìn)一步確認(rèn)冷脅迫下miRNA和靶基因的關(guān)系，選擇了5個(gè)miRNAs及其靶基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，在冷脅迫下miRNA-164a，miRNA-4411和miRNA-169e上調(diào)。相反的，他們的靶基因NAC、DRP和NFY顯著下調(diào)。說明miRNA和對應(yīng)靶基因呈負(fù)相關(guān)性。

圖3.miRNA和對應(yīng)靶基因qRT-PCR圖

為了近一步確認(rèn)這些差異表達(dá)miRNA的功能，對靶基因進(jìn)行GO分析。靶基因共參與了56個(gè)分子功能terms，37個(gè)生物學(xué)過程terms和7個(gè)細(xì)胞組分terms。在分子功能分類下，ATP結(jié)合、蛋白結(jié)合、組蛋白結(jié)合等terms是顯著富集的。超過35%miRNAs的靶基因參與了生物學(xué)過程途徑。

圖4.GO注釋

結(jié) 論
首次研究大豆冷脅迫下miRNA調(diào)控基因表達(dá)情況。利用降解組測序鑒定到了上百個(gè)靶基因，揭示miRNAs和靶基因之前的相互關(guān)系。盡管miRNAs調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，目前還不是十分清楚，本次研究完善了miRNA數(shù)據(jù)庫，為研究大豆和其他物種的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要基礎(chǔ)。也發(fā)現(xiàn)了51個(gè)響應(yīng)冷脅迫的miRNAs。

文章亮點(diǎn)
1.處理時(shí)間點(diǎn)的選擇上進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置多個(gè)時(shí)間梯度進(jìn)行處理并進(jìn)行生理指標(biāo)測定，最終選擇變化較為明顯的時(shí)期。選樣時(shí)間點(diǎn)有理有據(jù)。
2.利用降解組測序z確鑒定miRNA降解的mRNA。

參考文獻(xiàn)
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.