主要研究結(jié)果

1、亞洲棉基因組組裝更新

利用三代測(cè)序儀PacBio平臺(tái)共獲得142.54Gb的原始數(shù)據(jù)，組裝1.71Gb亞洲棉基因組，Contig N50=1.1 Mb，最長(zhǎng)的Contig為12.37 Mb。利用Hi-C技術(shù)獲得超過20×的reads，將組裝的1573Mb的數(shù)據(jù)定位到13條染色體上，與已經(jīng)發(fā)表的基因組相比，當(dāng)Hi-C數(shù)據(jù)比對(duì)到更新的基因組后，對(duì)角線外的不一致性明顯減少（見圖1a和b）。

注：a. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉原基因組比對(duì)；b. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉更新基因組比對(duì)

2、二倍體棉花群體遺傳進(jìn)化分析

共計(jì)選擇了243份二倍體棉花材料：230份亞洲棉G. arboreum?(A2)?和13份草棉G. herbaceum?(A1)，來自于中國(guó)南部(SC)，長(zhǎng)江(YZR)和黃河（YER）。以雷蒙德氏棉（G. raimondii）為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，G. herbaceum（草棉）和G. arboretum（亞洲棉）聚類成2個(gè)獨(dú)立的群（見圖2a和b）。G. arboretum（亞洲棉）進(jìn)一步又分為SC，YZR和YER三個(gè)群，顯示了地理分布模式的差異，進(jìn)而利用PCA分析支持這一結(jié)果（見圖2c）。

圖2 二倍體棉花的群體分層分析

注：a，243份二倍體棉花系統(tǒng)發(fā)育樹；b，243份二倍體棉花的群體結(jié)構(gòu)分析c，PCA主成分分析（中國(guó)亞洲棉的PCA分析；亞洲棉和草棉的PCA分析）

3、選擇性清除分析與GWAS分析

人工選擇在農(nóng)作物的馴化和遷徙的過程中具有重要的作用。群體結(jié)構(gòu)分析顯示當(dāng)K=4時(shí)，YER與SC和YZR明顯不同（圖2b，K=4）。通過兩兩群體間的選擇性清除分析（FST）鑒定出了分別覆蓋到59，53和51個(gè)顯著遺傳分化的區(qū)域。SC和YZR之間的21個(gè)分化的區(qū)域（約43.5 Mb?含有915個(gè)基因）在群體SC和YER之間是保守的（圖3a）。對(duì)來自不同環(huán)境下的11個(gè)重要性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在98個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)中，其中25信號(hào)個(gè)來自基因區(qū)（外顯子或內(nèi)含子區(qū)），包含與形態(tài)性狀相關(guān)的8個(gè)信號(hào)區(qū)，與產(chǎn)量性狀相關(guān)的6個(gè)信號(hào)區(qū)，與油籽性狀相關(guān)的3個(gè)信號(hào)區(qū)；剩余73個(gè)信號(hào)來自非編碼區(qū)。大部分農(nóng)藝性狀的GWAS關(guān)聯(lián)信號(hào)中顯示地理差異，如分支數(shù)，開花期，鈴重和抗病性這些性狀定位在保守的基因區(qū)（圖4b）。

參考文獻(xiàn)：Du X, Huang G, He S, et al. Resequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits[J]. Nature genetics, 2018, 50(6): 796.

圖1 陸地棉和海島棉染色體特征（含表觀遺傳標(biāo)記）

?2、陸地棉和海島棉染色體結(jié)構(gòu)變異分析

高質(zhì)量的參考基因組使研究人員直接通過比較基因組就能鑒定大的結(jié)構(gòu)變異成為可能。發(fā)現(xiàn)有170.2 Mb的基因組序列被鑒定為G. hirsutum和G. barbadense之間的倒位，包括120.4 Mb的At亞基因組和49.8 Mb的Dt在A06染色體中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)大的倒位變異，包括3個(gè)染色體臂內(nèi)倒位（in1, in3 and in4）和1個(gè)染色體臂間倒位（in2），通過Hi-C數(shù)據(jù)在斷點(diǎn)周圍離散的染色質(zhì)相互作用（圖2a），突出了Hi-C技術(shù)識(shí)別大規(guī)模染色體重排的優(yōu)勢(shì)。光學(xué)圖（BioNano optical maps）譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了這些反轉(zhuǎn)斷裂位點(diǎn)（圖2b）。

圖2，陸地棉和海島棉A06染色體倒位鑒定

注：a，Hi-C互作熱圖；b，光學(xué)圖譜鑒定

3、漸滲系的構(gòu)建及QTLs定位

由陸地棉Emian22作為受體親本，海島棉3-79作為供體親本構(gòu)建包含168個(gè)個(gè)體的CSSLs群體，旨在引入有利的變異，如纖維質(zhì)量。QTL定位分析，共鑒定到5個(gè)性狀的13個(gè)QTLs位點(diǎn)，其中控制纖維長(zhǎng)度位點(diǎn)2個(gè)，控制纖維強(qiáng)度位點(diǎn)4個(gè)，馬克隆值位點(diǎn)2個(gè)，纖維伸長(zhǎng)率位點(diǎn)2個(gè)，纖維均勻度位點(diǎn)3個(gè)（圖3）。在這些QTLs位點(diǎn)中，9個(gè)位點(diǎn)之前未被鑒定出，通過檢驗(yàn)13個(gè)QTLs中的基因表達(dá)水平，研究人員檢測(cè)到了235個(gè)在纖維發(fā)育過程中高度表達(dá)的基因，同時(shí)還整合了基因組變異數(shù)據(jù)來預(yù)測(cè)候選基因，而這些基因值得進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位以確認(rèn)對(duì)這些性狀具有重要影響的基因。

圖4，QTL定位結(jié)果展示

注：a，陸地棉纖維質(zhì)量相關(guān)QTLs分布（紅框）；b，纖維長(zhǎng)度相關(guān)QTL定位；c，纖維伸長(zhǎng)率相關(guān)QTL定位

參考文獻(xiàn)：Wang M, Tu L, Yuan D, et al. Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons, Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense[J]. Nature genetics, 2019, 51(2): 224.

圖1?S. spontaneum?AP85-441染色體與高粱染色體的比對(duì)

2、基礎(chǔ)染色體數(shù)目的減少

AP85-441基因組的組裝顯示了S. spontaneum的染色體數(shù)目從10降到8，而這與頻繁復(fù)制的古復(fù)制染色體對(duì)相關(guān)，通過與高粱的聚類比對(duì)，發(fā)現(xiàn)高粱祖先5號(hào)染色體和8號(hào)染色體同源物經(jīng)歷了染色體裂變（見圖2）。SbChr05（A12）的祖先染色體斷裂分為兩個(gè)主要部分，即C5S（A12S）和C5L（A12L），分別轉(zhuǎn)移到SbChr06（A2）和SbChr07（A5）的祖先染色體；SbChr8（A11）的祖先染色體斷裂為兩個(gè)主要的部分，即C8S（A11S）和C8L（A11L），分別轉(zhuǎn)移到SbChr09（A6）和SbChr02（A7 + A9）的祖先染色體中。SbChr8和SsChr5之間及SbChr5和SsChr7之間近乎同源的短片段是在高粱與甘蔗分化前，高粱SSA形成于13.4 MYA同源基因的殘留物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，S5中較小的SSA區(qū)域和S8中SSA的較大區(qū)域在重排的AP85-441基因組中也是保守的。

圖2 禾本科染色體數(shù)進(jìn)化（高粱n = 10到甘蔗n = 8）

3、S. spontaneum的起源與遺傳多樣性分析

研究中對(duì)世界種質(zhì)資源庫(kù)的64份S. spontaneum材料進(jìn)行重測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其核苷酸多態(tài)性（π）[0.00021±0.000002 ]遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它克隆繁殖的作物，如馬鈴薯，木薯，葡萄和柑。通過PCA主成分分析及群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)64份材料分為3個(gè)群，這些群體也受到自然和地理起源推斷的64份種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的支持（見圖3），group1來源于菲律賓，印度尼西亞和巴布亞新幾內(nèi)亞；group2和group3來源于印度，巴基斯坦和伊朗。基因組倍性在三組中差異很大（從6x-16x）。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，表明不同的倍性可能是從祖先獨(dú)立進(jìn)化而來的。

圖3 64份甘蔗的群體結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系分析

參考文獻(xiàn)：Zhang J, Zhang X, Tang H, et al. Allele-defined genome of the autopolyploid sugarcane Saccharum spontaneum L[J]. Nature genetics, 2018, 50(11): 1565.

圖1 四倍體野生花生及兩個(gè)二倍體祖先熱圖評(píng)估

參考文獻(xiàn)：Yin D, Ji C, Ma X, et al. Genome of an allotetraploid wild peanut Arachis monticola: a de novo assembly[J]. GigaScience, 2018, 7(6): giy066.

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2、基因組測(cè)序、組裝及注釋

本研究基于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT）、高通量NGS和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Hi-C）技術(shù)組裝了高質(zhì)量的亞洲高緯度雜草稻W(wǎng)R04-6基因組。最終組裝出染色體水平的高質(zhì)量基因組，包含12條染色體，大小為373.93Gb，contigN50位6.09Mb。最后，去除重復(fù)序列后通過從頭預(yù)測(cè)、同源預(yù)測(cè)和RNA-seq分析共獲得41,385個(gè)基因，有96.32%的基因在NR，KOG,，GO，KEGG，TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了注釋（見圖3）。

圖3 Hi-C輔助基因組組裝熱圖

圖4 雜草稻基因組分布圖

3、比較基因組分析

利用OrthoMCL軟件檢測(cè)WR04-6、R498、Nipponbare和W1943（O. rufipogon）間核心的、非必須的和共有的基因家族。在WR04-6中鑒定到了909個(gè)擴(kuò)張的基因家族，并且通過通路分析顯示，這些基因在光合作用和呼吸作用中顯著富集（p<0.01），例如氧化磷酸化、光合作用和核糖體的KEGG途徑，考慮其可以作為遺傳改良的信號(hào)。以O. barthii作為外群構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示W(wǎng)R04-6與粳稻祖先的分化時(shí)間估計(jì)在3,706ya（1,235ya-6,326ya），見圖4。

圖4 以O(shè). barthii作為外群構(gòu)建的最大似然樹

參考文獻(xiàn)：Sun J, Ma D, Tang L, et al. Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game[J]. Molecular plant, 2019.

圖1 熱圖驗(yàn)證Hi-C輔助染色體組裝

??圖2 構(gòu)樹染色體分布圖

2、構(gòu)樹的基因組進(jìn)化

利用14個(gè)物種（無油樟、亞麻、毛楊、棉花、擬南芥、黃瓜、苜蓿、桑樹、構(gòu)樹、桃樹、葡萄、番茄、毛竹和玉米）的單拷貝直系同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹與桑樹在同一分支，在大約3100萬年前與桑樹分開，與桃子的分化時(shí)間在大約7800萬年前（見圖3），該結(jié)果被4DTv的分析結(jié)果所證實(shí)，通過Ks分析進(jìn)一步得到證實(shí)。

圖3 14個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)已報(bào)道的雙子葉植物祖先和譜系特異性WGD，本研究推測(cè)，古六倍化始祖的21條染色體至少經(jīng)歷了11次大的染色體融和（cfus）和2次染色體裂變后產(chǎn)生了?？浦虚g狀態(tài)的12條始祖染色體（見圖4）。?？频氖甲嫒旧w的數(shù)目與葫蘆科和楊柳科是相似的，但是與薔薇科（n = 9）、豆科（n = 6）、錦葵科（n = 16）和茄科（n = 16）是不同的。進(jìn)化推演分析表明，構(gòu)樹的染色體是從桑科的12條始祖染色體經(jīng)27次融合和28次裂變重構(gòu)的，說明構(gòu)樹基因組在進(jìn)化過程中至少經(jīng)歷了68次的染色體融合和裂變。

圖4 構(gòu)樹和其他6種植物基因組重構(gòu)的進(jìn)化推演

3、比較基因組分析

在構(gòu)樹基因組中共發(fā)現(xiàn)15,254個(gè)基因家族，與桑樹分化之后，有431個(gè)基因家族擴(kuò)張，230個(gè)基因家族收縮，表明在適應(yīng)進(jìn)化過程中，構(gòu)樹中更多的基因家族經(jīng)歷了擴(kuò)張而不是收縮。另外，與苜蓿、毛楊和甜橙相比，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生明顯收縮（58個(gè)家族共1,342個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，占蛋白編碼基因的4.4%）。肌動(dòng)蛋白在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育的很多層面扮演著重要的角色，在酵母和很多動(dòng)物中，肌動(dòng)蛋白僅被一個(gè)單基因編碼。在構(gòu)樹中僅發(fā)現(xiàn)4個(gè)肌動(dòng)蛋白，少于藻類、小立碗蘚和無油樟。

參考文獻(xiàn)：Peng X, Liu H, Chen P, et al. A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Provides New Insights into Its Forage and Papermaking Usage[J].?Molecular plant, 2019.

百邁客HI-C研究?jī)?yōu)勢(shì)百邁客自2016年初以來，利用Hi-C技術(shù)進(jìn)行染色體水平的基因組組裝及染色體三維構(gòu)象的研究，成功開發(fā)出六堿基、四堿基酶切方案，組裝、互作輕松拿下。在植物Hi-C領(lǐng)域，更是邁進(jìn)了一大步，在同行還只能處理植物活體樣本的時(shí)候，我們已經(jīng)可以輕松“駕馭”離體枝條。迄今為止，保持著近100%的建庫(kù)成功率，完成近300個(gè)物種，近千個(gè)文庫(kù)構(gòu)建；文庫(kù)含酶切位點(diǎn)的有效數(shù)據(jù)比例最高達(dá)93%以上，平均比例高達(dá)68%。另外百邁客在Hi-C技術(shù)方面獲得一個(gè)專利和兩個(gè)軟著。Nature Genetics、Nature Communications、Molecular Plant等一大波Hi-C的高分文章在審稿或已接收的路上，后續(xù)會(huì)陸續(xù)與大家見面，敬請(qǐng)期待~~

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