1.1適用范圍
本指南介紹百邁客平臺單細胞產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細閱讀。
1.2聲明
我國法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風疹、麻風病、急性出血性結膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。
涉及上述傳染病的科學研究需符合國家的相關規(guī)定，為嚴格遵守國家法律法規(guī)，本著對社會及相關操作人員負責的態(tài)度，我司要求客戶方真實準確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進行事先說明。樣品中含有上述感染性病原體時，客戶方需要提供符合生物安全等級要求的實驗室以便開展相關實驗，實驗進行時，客戶方有義務協(xié)助我方實驗員做好實驗安全防護。客戶方不得隱瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進行相關項目，已產(chǎn)生的費用由客戶方承擔。如因客戶方提供的生物安全性信息不實、隱瞞樣品感染性等有關情況等造成實驗員及相關人員被感染、疾病傳播等嚴重后果的，我司將按規(guī)定報告國家相關部門，并將通過法律等手段追究相關責任。
2.1送樣量要求
目前百邁客單細胞產(chǎn)品包含：單細胞轉錄組、單細胞核轉錄組、單細胞免疫組庫、單細胞ATAC，不同類型單細胞產(chǎn)品具體送樣量要求如下表：
| 產(chǎn)品 | 樣本類型 | 樣本量要求 |
| 單細胞轉錄組、單細胞免疫組庫 | 常規(guī)新鮮組織 | ≥200mg |
| 脊髓、皮質(zhì)、腦膠質(zhì)瘤 | ≥300mg | |
| 關節(jié)滑膜 | ≥400mg | |
| 冠狀動脈、主動脈、椎間盤、脂肪、軟骨、硬骨、坐骨神經(jīng) | ≥500mg | |
| 穿刺樣本 | ≥3條 | |
| 外周血 | ≥3mL | |
| 腦脊液 | ≥10mL | |
| 腹水 | 5-10mL | |
| 肺泡灌洗液 | ≥50mL | |
| 流式分選細胞 | ≥5*105個 | |
| 原代/培養(yǎng)/凍存細胞 | ≥1*106個 | |
| 單細胞核轉錄組、單細胞ATAC | 組織 | ≥150mg（RNA提取另算） |
| 穿刺樣本 | ≥3條（長度大于1 cm） | |
| 外周血 | ≥3mL | |
| 流式分選細胞 | ≥5*105個 | |
| 原代/培養(yǎng)/凍存細胞 | ≥1*106個 |
2.2樣本質(zhì)量要求
| 產(chǎn)品名稱 | 質(zhì)控標準 |
| ?
單細胞轉錄組 單細胞免疫組庫 |
?
細胞總數(shù)：＞5×105個； 活性：> 85%； 直徑：<40μm； 體積：> 100μl； 濃度：700~1200 cell/μl； 結團率：<15%； 不含Ca2+、Mg2+ |
| ?
單細胞ATAC 單細胞核轉錄組 |
?
細胞總數(shù)：＞5×105個（最少為1×105個）； 細胞活性：＜5%； 體積：> 100μl； 濃度：700~1200 nucleus/μl； 結團率：<10%； 核膜完整性：將細胞核分為 ABCD級，要求A級細胞核>80% |
3.1動物單細胞轉錄組/單細胞免疫組庫
3.1.1 新鮮動物組織樣本
1）采集前準備：
實驗前分別提前24小時4℃預冷4個冰袋，-20℃預冷2個冰袋。
2）組織處理：
A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為200mg（黃豆粒大?。?；
B.去除周圍的脂肪、結締組織或者壞死組織，用預冷的無菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉血水等雜質(zhì)；
C.將清洗干凈的目標組織樣本切割成5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過1cm，保證組織塊能夠充分接觸組織保存液，完全浸沒在組織保存液中，快速轉移到解離實驗室進行單細胞懸液制備，或者寄送到百邁客實驗室進行解離。
3）樣本寄送與運輸：
A.離心管用Parafilm 封口膜密封好，在每個樣品管上清晰、簡明地標記樣品名稱（采用質(zhì)量較好的油性筆，并避免與乙醇等有機溶劑接觸），樣品名稱請避免出現(xiàn)漢字，采用字母和數(shù)字表示，長度控制在8個字符以內(nèi)；
B.樣本管用氣泡膜或紗布包裹，避免樣品管直接接觸冰袋而導致組織冰凍而壞死，請根據(jù)運輸時間確認冰袋的數(shù)量，確保樣本運輸?shù)竭_目的地時，樣本溫度保持在2-8℃。
4）注意事項：
A.取樣時用無菌手術刀或剪刀進行取樣，如必須用電刀取樣請避免電刀灼燒部位，取樣避免壞死部位，取樣不能有血凝塊；
B.公司承接樣本及樣本注意事項詳情請見”單細胞（核）物種組織白名單”。
C.采樣前可以提前聯(lián)系百邁客當?shù)劁N售經(jīng)理獲取組織保護液，由百邁客實驗室寄送分裝好的組織保存液（美天旎，貨號130-100-008），組織保護液在2-8℃保存，不建議過多囤放以防滋生細菌，使用前觀察試劑狀態(tài)是否為無色透明液體，無沉淀、無異樣；
D.組織在組織保護液中的最佳儲存時間為48h，可維持組織樣本的細胞活性及完整細胞表位，具體操作方法可參考《百邁客組織保存液寄樣指南》視頻，可以聯(lián)系百邁客當?shù)劁N售經(jīng)理獲取。
送樣不規(guī)范示例：
A.樣本沒有紗布包裹，與冰袋直接接觸，導致樣本結冰，解離活率不足；
B.組織太多，占滿整個管子，組織與保護液接觸面積很少，使保護液無法有效的保持組織活性；
C.樣本結冰，組織被完全凍住，解離活率很低；
D.未將管口包裹住，樣本運輸過程中管口打開，保護液和部分組織灑落在管外。
3.1.2 血液樣本
1）樣本采集：
A.采集新鮮外周血至少3mL，迅速置于EDTA抗凝管（紫色）中保存，取樣完成后需要立即輕柔管上下顛倒采血管4-6次，保證EDTA抗凝效果；
B.4℃、24h內(nèi)轉移到實驗室，分離PBMC后進行后續(xù)實驗；
C.或者利用淋巴細胞分離液分選出外周血單核細胞PBMC（分選步驟可參考第3.2部分），加入細胞凍存液梯度凍存，具體操作見第3.1.3部分（推薦上門服務）；
2）樣本寄送與運輸：
A.離心管用Parafilm 封口膜密封好，在每個樣品管上清晰、簡明地標記樣品名稱（采用質(zhì)量較好的油性筆，并避免與乙醇等有機溶劑接觸），樣品名稱請避免出現(xiàn)漢字，采用字母和數(shù)字表示，長度控制在8個字符以內(nèi)；
B.樣本管用氣泡膜包裹，避免樣品管直接接觸冰袋而導致組織冰凍而壞死，請根據(jù)運輸時間確認冰袋的數(shù)量，確保樣本運輸?shù)竭_目的地時，樣本溫度保持在2-8℃。
3）注意事項：
A.取樣前需要確認EDTA抗凝管在保質(zhì)期范圍內(nèi)，只能用EDTA紫色抗凝管；
B.百邁客可以提供PBMC分離服務；
C.血液離體時間不超過24h。
3.1.3 PBMC/細胞懸液樣本
PBMC樣本與細胞懸液樣本，如果沒有預約上門服務，需要按細胞梯度凍存的方式凍存起來，干冰寄送，細胞梯度凍存操作步驟如下：
A.凍存前準備：提前30min從-80℃冰箱取出梯度降溫盒并恢復至室溫備用；
B.準備好900μL血清+100μL DMSO的細胞凍存液；
C.收集PBMC或細胞，用預冷的無菌PBS清洗1-2遍，將配好的凍存液進行細胞重懸；
D.將重懸好的細胞懸液分裝到細胞凍存管中，并在凍存管側壁做好標記；
E.將凍存管放入梯度降溫盒中，放入-80℃冰箱，凍存的細胞在梯度降溫盒中放置24h后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上進行冷凍運輸，寄送到百邁客實驗室。
3.1.4 穿刺樣本
1）樣本采集：對于穿刺樣本，在采集樣本過程中，使用粗針(穿刺針管外徑≥1.2mm)穿刺采集3條樣本。
2）注意事項：
A.組織處理、樣本寄送與運輸參考第1.1部分；
B.采集時需注意的是不能用真空針采樣；
C.穿刺樣品量較少，建議送樣量≥3條，通過增加穿刺樣本數(shù)可以提高成功率。
3.2 動物單細胞核轉錄組/單細胞ATAC
3.2.1 冷凍組織樣品
1）樣本采集與寄送：
A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為250mg；
B.去除周圍的脂肪、結締組織或者壞死組織，用預冷的無菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉血水等雜質(zhì)，并用紗布或無塵紙擦干組織表面水分；
C.將清洗干凈的目標組織樣本切割成5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過1cm，組織分成兩份，一份150mg，一份100mg并做區(qū)分標記，分別轉入兩個凍存管中，150mg提取細胞核，100mg提取質(zhì)檢RNA（要求 RIN≥6.0）；
D.立即液氮速凍30min以上，再轉移到-80℃保存或干冰寄送，確保組織寄送到實驗室后為冷凍狀態(tài)。
2）注意事項：
心臟、肌肉、皮膚、肺癌、子宮、病變纖維化和器官硬化類組織，提核后會產(chǎn)生較多的碎片，需要進行流式分選去碎片；如果涉及到以上樣本，請送樣前提前告知，以便開始提核實驗前預約好流式細胞儀，以免耽誤實驗進度。
3.2.2 凍存細胞樣本
1）凍存前細胞質(zhì)檢：凍存前對細胞質(zhì)量進行檢測，要求細胞活性大于90%、細胞結團率小于 10%，樣品無細胞碎片等雜質(zhì)；原代細胞或培養(yǎng)細胞總數(shù)大于1×106個，流式分選細胞大于5×105個，并提供質(zhì)檢結果。
2）細胞梯度凍存：
A.凍存前準備：提前30min從-80℃冰箱取出梯度降溫盒并恢復至室溫備用；
B.準備好900μL血清+100μL DMSO的細胞凍存液；
C.收集PBMC或細胞，用預冷的無菌PBS清洗1-2遍，將配好的凍存液進行細胞重懸；
D.將重懸好的細胞懸液分裝到細胞凍存管中，并在凍存管側壁做好標記；
E.將凍存管放入梯度降溫盒中，放入-80℃冰箱，凍存的細胞在梯度降溫盒中放置24h后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上進行冷凍運輸，寄送到百邁客實驗室。
3.2.3 其他類
血液樣本參考第3.1.2部分，PBMC/細胞懸液樣本參考第3.1.3部分，推薦直接上門服務。
3.3?植物單細胞核轉錄組
3.3.1?新鮮植物組織樣品
1）活體植株（優(yōu)先推薦）
A.幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗（7-14 天）、組培苗——葉片、幼嫩莖、莖尖、根尖；
B.成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2片幼嫩葉片、發(fā)育中的花或者花序；
C.取樣量：保證每一個單細胞核轉錄組文庫的理論用量 0.5-2g；
D.其它：特殊貴重活體樣品需要客戶提供樣品的種植、保存條件（溫度、光照、營養(yǎng)液、澆水條件、PH 等等），以保證樣品的正常生長；
E.每一個根部保留少量土壤，利用錫箔紙或者塑料薄膜將植株根部包裹起來， 植株部分需要利用小鐵環(huán)或者絲帶纏繞，保證枝條莖葉不分散，但不需要捆綁非常緊實，防止機械對莖枝葉的損傷。
F.外面用紙箱或者泡沫包裹，防止植株碰撞，并用塑料薄膜纏繞固定。
G.一般活體植株常溫運輸培養(yǎng)，如果有特殊培養(yǎng)條件（需要做相應的處理，例如，低溫用冰袋運輸，冰袋與密封袋之間放置泡沫板）。
2）離體枝條
A.枝條選擇：枝條頂端有待萌發(fā)葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉；枝條中下端保留部分成熟葉片；
B.枝條預處理：剪斷枝條，自底端往上約5cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋，袋中噴水，填充部分空氣，密封袋口；
C.枝條運輸：自封袋放入泡沫箱，箱體內(nèi)側壁放部分冰袋（保證低溫運輸），冰袋與自封袋間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導致樣品被凍傷；
D.運輸時間：保證24 h內(nèi)到樣，最多不得超過48 h；
E.取樣量：保證每一個單細胞核轉錄組文庫的理論用量 0.5-2g；
F.其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項目，如野外采樣、植株過大等導致的取樣或運輸比較困難的項目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實驗；離體枝條如果保存、運輸不善會存在部分潛在風險：即得到的實驗效果可能會比活體植株檢測結果稍差（理論上的潛在風險）。
3）注意事項
A.建議一次送樣量≥2g；
B.所有待取的幼嫩組織長勢必須正常（無病蟲害、無營養(yǎng)缺失）；
C.對于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第 1-2 片嫩葉；
D.部分植物單細胞核項目（物種及組織類型在我司白名單之外）在正式啟動前會進行預實驗以判斷能否順利開展正式實驗，故活體樣本送樣時應保證至少3天的啟動延時（即活體樣本到樣后需等待3天至預實驗合格后方能正式啟動樣本，如對時期要求嚴格的樣本需格外注意），送樣前可與我司溝通確認具體情況。
白菜植株
打包后的白菜植株
3.3.2?冷凍組織樣品
1）樣本采集與寄送：
A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為700 mg；
B.去除周圍的非目標組織，用預冷的無菌PBS或者生理鹽水清洗2遍，清洗掉雜質(zhì)；
C.將清洗干凈的目標組織樣本切割成0.5cm-1cm左右的組織塊，盡量不超過1cm，剪切成約0.5 cm,不足0.5 cm的從中間切開即可；
D.將組織分成兩份，一份600mg，一份100mg并做區(qū)分標記，其中600 mg用來提取細胞核，100 mg用來提取 RNA（要求 RIN≥7.0）；
E.立即液氮速凍30min以上，再轉移到-80℃保存或干冰寄送，確保組織寄送到實驗室后為冷凍狀態(tài)。
圖1 百邁客單細胞測序服務流程
4.1 懸液制備方案評估
由于不同物種和組織類型的解離條件差異較大，百邁客提供單細胞懸液制備預實驗服務，會對目標組織類型的單細胞懸液制備方案進行評估。提前預約好樣本寄送時間，保證到樣后盡快開展單細胞懸液制備實驗，組織凍存液寄送樣本最好在48h內(nèi)完成解離；確定好細胞懸液制備方案后，即可正式開展項目。
4.2 正式實驗
目前百邁客提供兩種類型的正式實驗服務模式：
4.2.1 上門服務
老師只需提供組織樣本，預約上門后實驗工程師上門，按照預實驗評估的解離方案進行解離、單細胞分選上機、反轉錄成cDNA后低溫暫存，后續(xù)在百邁客實驗室完成建庫測序。
或者老師完成單細胞懸液制備實驗，實驗工程師進行單細胞懸液質(zhì)量評估，評估合格后進行后續(xù)實驗操作，單細胞質(zhì)量要求見第2.2部分。
備注：單細胞懸液制備好后，建議在30分鐘內(nèi)質(zhì)檢上機，建議老師提前安排好時間；儀器設備要求詳情見第4.3.3部分。
4.2.2 組織寄送
百邁客單細胞組織保存液寄送方式（推薦），采用組織保存液儲存組織樣本，既可以保持樣本最原始組織活性狀態(tài)，又可以解決樣本難以獲取以及批次性效應等問題，老師寄送組織到百邁客實驗室，實驗工程師進行解離、單細胞分選上機、反轉錄、建庫、測序。
注意事項
- 根據(jù)組織類型選擇服務模式：適用于組織保存液寄送的組織推薦組織，寄送，其他不適用寄送的組織類型、細胞、血液樣本推薦上門服務；
- 一些特殊樣本由于組織結構、細胞大小等限制，在不適用單細胞轉錄組測序的情況下，可以進行單細胞核轉錄組測序。
| 細胞類型 | 說明 |
| 神經(jīng)元細胞 | 4~120μm,常見星形、錐體形、梨形和圓球形狀，長突起細胞 |
| 巨噬細胞 | ~50μm, 多突起的星形細胞 |
| 皮下脂肪細胞 | 60~120μm，粒徑過大 |
| 心肌細胞 | 3~100μm，類型復雜非規(guī)則球形，移行細胞細長型，特別心肌腫大時細胞粒徑會達100μm |
| 腎臟細胞 | 系膜細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞（足細胞）、腎小管上皮細胞，類型復雜，足細胞豐度低 |
| 骨骼肌纖維 | 長柱形的多核細胞，長1~40mm，直徑10~100μm |
| 卵細胞 | >0.1mm，成熟卵泡直徑18-25mm |
4.2.3 儀器耗材清單
| 設備及描述 | 儀器要求 | 用途 |
| 冰箱 | -80℃、-20℃ | 暫存試劑 |
| 4℃水平離心機* | 支持1.5ml/15ml離心管 | 解離液分離；細胞收集 |
| 制冰機和冰盒 | — | 解離中提供低溫環(huán)境 |
| PCR儀* | 支持100 μL反應體系；熱蓋溫度可調(diào)節(jié) | 用于反轉錄反應 |
| 漩渦振蕩器* | — | 混勻試劑 |
| 微型離心機* | 兼容0.2mL、八連排和1.5mL 離心管 | 瞬時離心 |
| 震蕩水浴鍋* | 37℃恒溫 | 酶解離組織 |
| 生物安全柜 | 無菌環(huán)境 | 組織解離 |
| 光學顯微鏡 | 至少200x | 觀察形態(tài) |
| 75%乙醇 | 如果是無水乙醇，同時準備去離子水 | 消毒 |
| 無塵紙 | — | — |
| 手術剪刀 | ～10cm | 剪碎組織 |
| 手術鑷子 | ～15cm | 夾取/轉移組織 |
| 無酶吸頭 | 1mL/200uL/10uL多種規(guī)格無酶吸頭 | — |
| 離心管架 | 可放置15ml、50ml離心管 | 放置離心管 |
| 離心管 | 0.2/1.5/ 2.0/15/ 50 mL滅菌離心管 | — |
注意事項：
1）標記*的設備需放置在同一房間；
2）實驗臺大小要求能滿足兩名實驗員操作；
3）三孔儀器電源插座大于3 個；
4）生物安全柜可用常規(guī)實驗臺代替。
4.3 風險提示與評估
1）組織保存液寄送樣本盡量保證48h內(nèi)寄送到實驗室開展實驗，時間過長會影響細胞活率及細胞表達狀態(tài)；
2）單細胞核轉錄組組織樣本一定要備份進行質(zhì)檢（RIN值≥6.0），RNA完整性會影響數(shù)據(jù)結果；
3）細胞活率低于85%，可能引起mRNA部分降解導致基因檢出減少，細胞內(nèi)線粒體基因比例偏高，占用有效數(shù)據(jù)量；
4）細胞直徑<40 μm（10x）或<60 μm（DG）細胞過大容易堵塞芯片，無法形成油包水，過大的細胞利用細胞篩過濾；
5）細胞結團<15%，組織解離不充分，會看到細胞懸液中2個或多個細胞粘連在一起的情況，可能會導致最終數(shù)據(jù)中雙細胞占比偏多，占用有效數(shù)據(jù)量，結團過高還可能會堵塞芯片，無法形成油包水；
6）解離過程中可能由于解離條件過于劇烈而產(chǎn)生大量碎片，可能會導致背景噪音高，占用有效數(shù)據(jù)量，也會引起有效細胞數(shù)偏離預期。
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細胞學說提出“細胞是動物和植物結構和生命活動的基本單位”，只有充分了解細胞的特性與功能，才能深入理解生命現(xiàn)象的深層機制，才能明晰生物體生長發(fā)育的規(guī)律，才能辨明疾病發(fā)生發(fā)展的原因。單細胞測序（single-cell sequencing）在單細胞水平研究細胞的功能和細胞互作網(wǎng)絡，幫助我們深層次理解生命機制。
2013-2020?年，單細胞測序技術多次被?Science、Nature?等學術期刊評價為年度重點技術，正引領新一輪生物醫(yī)學領域的技術革命；在腫瘤、神經(jīng)學、免疫、感染性疾病、生長發(fā)育和生殖健康等領域得到廣泛應用。
提到單細胞測序，我們腦中更多浮現(xiàn)得是scRNA-Seq(single-cell RNA -sequencing)；scRNA-seq是目前常用的單細胞測序技術，但是逐漸呈現(xiàn)出一些固有的方法學問題：組織類型偏好（無法分析難解離的組織和凍存組織等）；在細胞懸液制備中會引入一些轉錄偏好；組織解離時得到易于解離下來的細胞，敏感的細胞可能在解離時破碎；目前商業(yè)化的單細胞平臺都對細胞大小有限制等。
snRNA-seq(single-nucleus RNA-sequencing)以其獨特的優(yōu)勢受到研究者的青睞，逐漸呈現(xiàn)出較為火熱的景象。目前在多種動植物組織，如腫瘤組織[1]、腦[7]、腎臟[3]、心臟[8]和脂肪[4]中得到應用，在植物單細胞中也逐漸展現(xiàn)了其優(yōu)勢[5]。snRNA-seq是否可以和scRNA-Seq一樣，得到一致的結果，解析生物學特征，兩者之間有哪些差異，下面幾篇文獻可以略解您的疑慮，帶您初識snRNA-seq。
scRNA-Seq和?snRNA-seq方法比較文獻解析
1、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.
發(fā)表雜志：Nature Medicine
影響因子：36.13
發(fā)表時間：2020. 6. 25
實驗平臺：10x Chromium
實驗材料：新鮮和凍存的8種腫瘤組織，如NSCLC（非小細胞肺癌）， ?NB（成神經(jīng)細胞瘤），MBC（轉移性乳腺癌），GBM（腦膠質(zhì)瘤），CLL（慢性淋巴細胞白血?。?，Ovarian（卵巢癌），Melanoma（黑色素瘤）和肉瘤。
研究內(nèi)容：開發(fā)了一種系統(tǒng)工具箱，可以分別通過scRNA-Seq和 ?snRNA-Seq對新鮮和冷凍的臨床腫瘤樣品進行分析；對同樣的樣品進行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析，結果顯示它們可以得到相同的細胞類型，但是每種細胞類型的占比不同。
主要結果：
a.?建立了系統(tǒng)性的scRNA-Seq和snRNA-Seq的實驗流程和數(shù)據(jù)分析流程
研究了8種不同類型的腫瘤組織，通過不同取樣方式，共獲得不同部位共23個標本的40個樣品的216,490個細胞和細胞核，這些樣品具有豐富的組織和樣品多樣性；對不同的細胞和細胞核分離方式，在實驗和數(shù)據(jù)分析中對細胞/細胞核質(zhì)量、細胞/細胞核回收率、靈敏度、細胞類型和CNV 分析等方面進行評估，確定了實驗流程和數(shù)據(jù)分析流程（圖1-1）；通過對8種腫瘤組織實驗和數(shù)據(jù)分析結果比較，推薦了細胞和細胞核分離方式（圖1-2）。
圖1-1 sc/snRNA-Seq 實驗和數(shù)據(jù)分析流程
圖1-2 不同腫瘤組織樣品信息和細胞/細胞核分離方式
對成神經(jīng)細胞瘤（HTAPP-656）、轉移性乳腺癌?(HTAPP-963)、CLL (CLL1) 和 O-PDX (O-PDX1)相同的樣品同時進行scRNA-Seq和snRNA-Seq分析。兩種方法可以得到相同的細胞類型，但是每種細胞類型的占比不同；在成神經(jīng)細胞瘤和轉移性乳腺癌中，scRNA-Seq獲得更多的免疫細胞，snRNA-Seq得到更多的惡性腫瘤細胞（圖1-3）；細胞檢測到解離信號的比例比細胞核高，且信號值較高；在細胞和細胞核中，免疫細胞和基質(zhì)細胞的解離信號更加明顯（圖1-4）。
圖1-3 scRNA-Seq and snRNA-Seq結果比較
圖1-4 ?scRNA-Seq and snRNA-Seq解離信號比較
2.Systematic comparison of single-cell and?single-nucleus RNA-sequencing methods
發(fā)表雜志：Nature biotechnology影響因子：36.558發(fā)表時間：2020. 4. 6實驗平臺：scRNA-Seq:低通量(Smart-seq2和CEL-Seq2）和高通量(10x Chromium、Drop-Seq、Seq-Well、inDrops和sci-RNA-seq)snRNA-Seq:Smart-seq2、10x Chromium、DroNc-Seq和sci-RNA-seq
scRNA-Seq：人（HEK293）和小鼠（NIH3T3）等比例混合細胞系和凍存人類PBMC（2個生物學重復）；snRNA-Seq：凍存小鼠大腦皮層（2個生物學重復）Bulk RNA-Seq：以上3種材料
研究內(nèi)容：選擇2種低通量和5種高通量方法進行scRNA-Seq或snRNA-Seq分析；為了直接比較、避免每種方法已有流程的影響，作者開發(fā)了一種更加靈活、適用于任何scRNA-Seq的方法“scumi”；通過比較reads的結構和比對情況、靈敏度、多胞率和解釋已知的生物學信息評估每種方法；兩種低通量方法表現(xiàn)相似，CEL-Seq2受其他細胞污染reads的影響比較明顯；10x Chromium在高通量方法中表現(xiàn)更優(yōu)。
首先，開發(fā)了“scumi”軟件包，從FASTQ文件到產(chǎn)生適用下游分析的基因和細胞參數(shù)；其次，提出了下游分析前過濾低質(zhì)量細胞的方案，這也是數(shù)據(jù)預處理的重要挑戰(zhàn)，然后對每個實驗類型每個細胞進行相同的reads數(shù)分析；最后，通過關鍵的參數(shù)對每種方法進行評估：①比對到細胞核和線粒體基因組的reads 及其結構；②捕獲RNA的靈敏度；③多胞率；④準確性和重復性；⑤得到細胞類型中重要的生物學差異的能力（圖2-1）。
圖2-1 scumi數(shù)據(jù)分析流程
b.?reads結構和比對到基因組的信息顯示不同方法具有效率差異結果顯示，不同的方法在預期的位置沒有Poly（T）reads比例明顯不同；外顯子、內(nèi)含子、基因間、重疊的差異基因、多重比對以及無法比對的reads不同方法間基本一致；但是細胞核中內(nèi)含子reads與外顯子reads的比率明顯高于細胞，因為細胞核中有較高比例未剪切的轉錄本（圖2-2）。
圖2-2 測序reads的基因組比對特征（a. Mixture, b.PBMCs, c.Cortex ）
c.?不同實驗每種方法的靈敏度相對一致
結通過分析每個細胞的reads數(shù)、UMIs 和基因數(shù)比較每種方法的靈敏度（即捕獲RNA的能力）；7種方法中，低通量方法靈敏度最高，高通量方法中10x Chromium 每個細胞檢測到的UMI和基因數(shù)最多（圖2-3）。
圖2-3不同實驗每種方法的靈敏度比較
d.?不同的方法區(qū)別和獲得細胞類型的能力不同
選擇轉錄組分析方法最重要的一項指標就是這種方法能否解釋感興趣的生物學信息。為了更加公平的分析每種方法，我們對數(shù)據(jù)進行了一致性處理；選擇相同的Reads/cell 和cells/實驗進行細胞分群和細胞類型鑒定。
在PBMCs中，每種方法都可以獲得豐富的細胞類型，但是每種類型的豐度不同，且獲得稀有細胞類型的能力有差異（如漿狀樹突細胞）；每種方法都有一定程度的血小板污染。
在大腦皮層中，細胞核分析得到小鼠大腦皮層多種細胞類型，包括興奮和抑制性神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細胞,少膠質(zhì)細胞,少突膠質(zhì)祖細胞,小膠質(zhì)細胞,內(nèi)皮細胞和周皮細胞，其中周皮細胞只在DroNc-Seq Cortex1 中發(fā)現(xiàn)；sci-RNA-seq未得到少突膠質(zhì)祖細胞和小膠質(zhì)細胞（圖2-4）。
圖2-4不同實驗不同方法細胞類型的比較
3.Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA?Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis
發(fā)表期刊：J Am Soc Nephrol
影響因子：9.274
發(fā)表時間：2019.1
實驗平臺：
scRNA-seq ：DropSeq
snRNA-seq：sNuc-DropSeq, DroNc-seq和?10x Chromium
實驗材料：8周大的小鼠腎臟
研究內(nèi)容：
在比較分析中共產(chǎn)生?11,391?個轉錄本。scRNA-seq鑒定了10個細胞簇，包括一個人為解離誘導的壓力相應基因群，但是未鑒定到腎小球細胞。相反，3種snRNA-seq都鑒定到更加多樣性的腎細胞類型，包括腎小球足細胞，系膜細胞和內(nèi)皮細胞，未檢測到壓力響應基因；檢測到的腎小球足細胞的比例是已知發(fā)表的scRNA-seq 數(shù)據(jù)的20倍（2.4% versus 0.12%）。更出乎意料的是，snRNA-seq和scRNA-seq 的基因檢測靈敏度一致。為了驗證snRNA-se方法的有效性，分析了經(jīng)過纖維化和炎癥UUO治療第14天冷凍腎組織，鑒定了罕見近腎小球細胞，新活化的近端小管和成纖維細胞細胞狀態(tài)，以及之前未知的腎小管間質(zhì)信號通路。
圖3-1?內(nèi)含子對snRNA-seq?數(shù)據(jù)的影響
b.?snRNA-seq鑒定了3個特有的細胞類型
將4種方法的數(shù)據(jù)整合分析，共鑒定了13個細胞簇，包括足細胞，內(nèi)皮細胞和腎小球膜細胞；3種snRNA-seq 檢測足細胞，內(nèi)皮細胞和閏細胞的靈敏度更高；但是scRNA-seq未檢測到任何足細胞。差異基因表達分析顯示，?71.4%?基因在細胞和細胞核中都被檢測到；在檢測到的基因中，僅僅?5.0%?在細胞中的表達量高于細胞核，6.4%的基因在細胞核中的表達量高于細胞（fold change>1.5，?P value <0.05）（圖3-2）；scRNA-seq高表達基因包括線粒體、核糖體基因和熱休克途徑中的基因；snRNA-seq高表達基因包括溶質(zhì)載體、轉錄因子和Non-coding?RNA基因。
圖3-2 ??snRNA-seq?和scRNA-seq?差異分析?
?c.??snRNA-seq?分析經(jīng)過纖維化和炎癥UUO治療的冷凍腎組織
圖3-3 ??snRNA-seq?對UUO治療冷凍腎組織的分析結果
snRNA-seq應用好文推薦
4. snRNA-seq reveals a subpopulation of?adipocytes that regulates?thermogenesis
發(fā)表信息：Nature；2020.10.28；IF：42.778。
單細胞平臺：Smart-Seq2?和10x Chromium
推薦理由:
通過對小鼠和人進行單細胞核轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)脂肪組織中的新的細胞類型P4；通過對marker基因Cyp2e1和Aldh1a1的深度分析確定P4的主要功能，如免疫熒光染色，基因過表達、基因敲除，共表達等功能驗證技術。證明了這個亞群通過醋酸鹽介導的調(diào)節(jié)其產(chǎn)熱能力來調(diào)節(jié)鄰近脂肪細胞的活動。人類脂肪組織中含有較高數(shù)量的該亞群細胞，這可能解釋了與小鼠脂肪組織相比，人的產(chǎn)熱活性較低的原因，并提示靶向該途徑可用于恢復產(chǎn)熱活性。
5. The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana?
發(fā)表信息：bioRxiv preprint；doi:?https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156；?2020.07.28
單細胞平臺：10x Chromium
推薦理由:
利用原生質(zhì)體進行單細胞轉錄組測序困難重重，如原生質(zhì)體獲得困難（不同物種、不同發(fā)育時期和不同器官細胞壁成分不同），解離對基因表達的影響，原生質(zhì)體細胞大小超出平臺的限制等；為了克服原生質(zhì)體的困難，作者進行了單細胞核轉錄組分析；與已經(jīng)發(fā)表的文章相比，不僅驗證了單細胞核轉錄組可以對擬南芥根進行分析，同時還發(fā)現(xiàn)了3種新的細胞類型；通過單細胞ATAC-Seq和snRNA-Seq?多組學聯(lián)合分析揭示染色質(zhì)重塑對基因轉錄的影響，證明細胞類型特異性標記基因也顯示細胞類型特異性的染色質(zhì)可及性模式。我們的數(shù)據(jù)表明，染色質(zhì)的不同重塑是在細胞類型水平上調(diào)控基因活動的關鍵機制。
結束語
綜上所述，snRNA-Seq?分析細胞核內(nèi)的RNA，可以解釋相應的生物學信息；snRNA-Seq?含有較多未剪切的轉錄本，包含內(nèi)含子的序列進行分析，不僅可以提高提高RNA的捕獲能力，同時可以得到更多的稀有細胞類型；snRNA-seq解決了scRNA-seq中固有的一些問題，能夠獲得更為準確可靠的結果。
近幾年來，snRNA-Seq受到越來越多的青睞，文獻增長趨勢較為迅速；為特殊樣品（如冷凍組織）的單細胞研究提供新的途徑；為細胞單細胞研究開辟了新的思路。
snRNA-Seq和scRNA-Seq?是目前解析各種生命現(xiàn)象、揭示各種生物學機制的強有力的技術手段，各有千秋，研究者需要結合自身的條件來確定；如scRNA-Seq在神經(jīng)小膠質(zhì)細胞激活態(tài)（microglial activation）的研究中更勝一籌[6]。我們期待越來越多的研究者來解析單細胞轉錄學這浩瀚的星空，發(fā)現(xiàn)更多耀眼的星。
百邁客引進10xGenomics單細胞測序平臺，使用Chromium系統(tǒng)采用微流控、油滴包裹和barcode標記等技術實現(xiàn)一次性分離、高效標記捕獲；同時具有10x?單細胞轉錄組、單細胞核轉錄組、空間轉錄組、單細胞免疫組庫、全長轉錄組測序，實現(xiàn)10x平臺全面優(yōu)質(zhì)服務；已經(jīng)具有大量單細胞分離捕獲，極低量RNA反轉錄擴增建庫成功經(jīng)驗；提供單細胞分離捕獲、反轉錄建庫、測序、標準分析和高級分析全套單細胞測序服務；強大的生信團隊不僅提供基本分析，還提供細胞分化軌跡分析等多種高級分析；資深單細胞技術人員為您提供專業(yè)的課題方案設計，為您量身訂造專屬個性化分析。點擊下方按鈕聯(lián)系我們，將可免費獲得文章思路設計方案。
參考文獻
[1]A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.Michal Slyper, Caroline B. M. Porter, Orr Ashenberg, et al .Nature Medicine ,May 2020,VOL 26:792-802
[2]Systematic comparison of single-cell and ?single-nucleus RNA-sequencing methods.Jiarui Ding, Xian Adiconis, Sean K. Simmons, et al.Nature Biotechnology,Nat Biotechnol. 2020 Jun,38(6):737-746
[3]Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis.Haojia Wu, Yuhei Kirita, Erinn L. Donnelly,et al.J Am Soc Nephrol,2019(30): 23-32
[4]snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis.Wenfei Sun,Hua Dong,Miroslav Balaz, et al.Published online: 28 October 2020.
[5]Andrew Farmer1, Sandra Thibivilliers , Kook Hui Ryu,??et al.The impact of chromatin remodeling on gene expression at the single cell level in Arabidopsis thaliana.bioRxiv preprint,doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.27.223156;2020.07.28
[6]Single-Nucleus RNA-Seq Is Not Suitable for Detection of Microglial Activation Genes in Humans.Nicola Thrupp, Carlo Sala Frigerio, Leen Wolfs, et al.Cell Reports , 2020(32):1-8
[7]Dissecting Cell-Type Composition and Activity_Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.Peng Hu, Emily Fabyanic,Deborah Y. Kwon, Sheng Tang,Zhaolan Zhou, Hao Wu.Molecular Cell.2017(68):1006–1015
[8]Systematic Comparison of High throughput Single-Cell and Single Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Diferentiation.Alan Selewa1, Ryan Dohn1, Heather Eckart, et al.Nature Scientific Reports | (2020) 10:1535
]]>中文題目：scWGS揭示阿爾茨海默病神經(jīng)元的體細胞基因組遺傳變化
英文題目：Somatic genomic changes in single Alzheimer’s disease neurons
發(fā)表雜志：Nature
影響因子：69.5
發(fā)表日期：202204
發(fā)表單位：哈弗醫(yī)學院
研究背景
阿爾茨海默氏癥的癡呆癥隨著神經(jīng)變性的進展而發(fā)展，但導致神經(jīng)元功能障礙和死亡的具體事件仍然鮮為人知。在正常衰老期間，神經(jīng)元以類似于分裂細胞的速度逐漸積累軀體突變，這表明遺傳因素、環(huán)境暴露或疾病狀態(tài)可能會影響這種積累在這里，本文分析了來自阿爾茨海默病患者和神經(jīng)典型對照個體前額葉皮層和海馬體的319個神經(jīng)元的單細胞全基因組測序（scWGS）數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默氏癥患者的體細胞DNA改變增加，分子模式不同，正常神經(jīng)元主要以與年齡相關的模式（特征A）積累突變，這與之前在健康和癌細胞中描述的“時鐘狀”突變特征非常相似。神經(jīng)變性中DNA改變的異常積累為阿爾茨海默病發(fā)展過程中發(fā)生的分子和細胞事件的級聯(lián)提供了見解。
材料方法
材料：年輕的神經(jīng)典型對照組（9人）、老年神經(jīng)典型對照組（11人）、阿爾茨海默氏病患者（9人）；一共29人，總計：319個神經(jīng)元，172個PFC-MDA神經(jīng)元，78個HC-MDA神經(jīng)元，69個PFC-PTA神經(jīng)元
方法：對319個神經(jīng)元進行單細胞全基因組測序。
研究結論
AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過了僅因衰老而發(fā)生的水平。AD神經(jīng)元中基因組SNV積累的模式似乎與正常衰老的加重不同，這表現(xiàn)為（1）特征C的豐富，特征C存在于神經(jīng)典型對照個體的大腦中，但有限；（2）特征特異性轉錄影響。這些基因組變化可能包括一系列表現(xiàn)形式，包括單鏈DNA病變和雙鏈突變。AD神經(jīng)元體細胞改變的具體模式還提供了關于其原因和AD發(fā)病機制潛在影響的線索并確定潛在的治療目標，scWGS技術深度揭示AD疾病發(fā)病機制與體細胞突變的積累有關，為其治療提供了理論基礎。
技術路線圖
主要研究結果
1、衰老期間神經(jīng)元的體細胞突變
對從AD和神經(jīng)典型對照個體的大腦中分離出來的神經(jīng)元進行了單細胞全基因組測序（scWGS），染色了泛神經(jīng)元標記NeuN來標記神經(jīng)元，并進一步只標記了大的NeuN陽性核，使用多位移放大（MDA）進行全基因組擴增，分析了8例AD的91個神經(jīng)元和18個神經(jīng)典型對照組的159個神經(jīng)元。在神經(jīng)典型個體中，神經(jīng)元sSNVs隨著年齡的增長而增加，sSNVs的年增長率相當高，從每年13到55個sSNV不等，在一些特殊細胞類型中，分裂突變率更高。沒有神經(jīng)診斷的個體的海馬CA1神經(jīng)元顯示，隨著年齡的增長，sSNVs呈積累的趨勢，這與神經(jīng)典型對照個體前額葉皮層（PFC）神經(jīng)元中看到的sSNV的增加沒有顯著差異。
圖1 對照個體和AD個體中單個神經(jīng)元的體細胞突變
在正常的PFC神經(jīng)元中，與年齡相關的突變增加主要由某些C>T和T>C變化驅(qū)動，從PFC和海馬錐體神經(jīng)元的復合數(shù)據(jù)集中對sSNVs進行簽名分解分析表明，簽名A在每個神經(jīng)元中的貢獻隨著年齡的增長而增加，每年獲得15.0±1.2 sSNVs。這種與年齡相關的特征A突變的增加與PFC和海馬錐體神經(jīng)元相似（P = 0.18，線性混合模型），并且是正常神經(jīng)元中與年齡相關的sSNV積累的主要驅(qū)動因素。轉錄可以通過轉錄相關損傷或無效修復使表達的位點對軀體突變敏感。
2、AD中的體細胞突變特征分析
評估了8名AD患者大腦神經(jīng)元中sSNVs的負擔，發(fā)現(xiàn)AD神經(jīng)元sSNVs明顯高于預期。AD神經(jīng)元在MDA實驗中也顯示sSNVs顯著增加。在PFC中，在八例AD個體病例中觀察到AD中sSNVs相對于正常衰老的顯著增加。AD中sSNV計數(shù)高的幾個基因組來自海馬體，其中8例中有5例與正常衰老相比，sSNVs顯著增加。AD中的神經(jīng)元包含數(shù)百種額外的sSNV，超出了其年齡的預期，這表明該疾病過程產(chǎn)生的基因組損傷水平與十多年來sSNV的正常積累相當。變異的廣泛基因組分布表明，體細胞突變不是構成疾病發(fā)病機制的特定初始事件，而是繼發(fā)性的，這是由引發(fā)AD和誘變過程的其他事件引起的。
AD神經(jīng)元的突變特征分析，在所有樣本中，A突變都會隨著年齡的增長而增加，這表明這種時鐘狀特征（與癌癥5的時鐘樣特征SBS5最相似）構成了基因組老化的固有特征。簽名A還顯示，相對于年齡匹配的控制，AD略有增加，這在這些MDA實驗中沒有達到統(tǒng)計學意義，但表明這些突變機制在疾病環(huán)境中可能會被強調(diào)。另一方面，AD神經(jīng)元與對照組相比，簽名C明顯增加。鑒于AD4.31-33中報告了活性氧（ROS）和氧化核酸病變的增加，在AD中積累標志性C的合理機制是，氧化損傷的增加壓倒了NER，而NER也可能在AD中也會減弱。
圖2 AD中的體細胞突變特征
由于我們的突變特征分析表明，DNA氧化——之前在AD4.11患者大腦的批量分析中觀察到——可能會導致AD中過量的sSNV，使用針對8-oxoG的抗體進行免疫熒光顯微鏡顯示，AD神經(jīng)元中的8-oxoG水平明顯高于神經(jīng)典型對照神經(jīng)元。表明氧化核苷酸損傷水平的增加有助于C>A變化和AD神經(jīng)元中標志性C的增加。
對神經(jīng)元功能和生存至關重要的基因突變可能會直接影響細胞適應性，對于簽名A，轉錄期間的事件似乎在產(chǎn)生突變方面發(fā)揮作用，而簽名C與表達式成反比，因此可以在轉錄期間更有效地修復，包括通過TC-NER35修復。對AD和對照神經(jīng)元中位突變的基因本體學（GO）分析顯示，參與神經(jīng)元功能的基因被sSNVs豐富。當與表達式-sSNV結果一起考慮時，AD神經(jīng)元顯示轉錄過程對突變生成的影響，這種轉錄影響可以在配對的DNA鏈上產(chǎn)生不對稱的突變模式。
在蛋白質(zhì)編碼基因中，AD神經(jīng)元表現(xiàn)出比年齡匹配的對照神經(jīng)元表現(xiàn)出更多的非同義突變，對AD37腦脊液和腦組織中的克隆CD8+ T細胞的觀察表明，這種自激活可能與AD有關。功能失調(diào)的神經(jīng)元在AD中會明顯更豐富，這可能會因某些AD相關基因的長度而加劇；因此損害神經(jīng)元功能可能是sSNVs影響細胞生理學的一種方式。
圖3 AD中的體細胞突變對轉錄組和蛋白表達的影響
3、PTA擴增對AD神經(jīng)元基因組突變特征分析
基于PTA（初級模板定向放大）的人類神經(jīng)元scWGS證實，體細胞突變隨著年齡的增長而增加。對MDA分析的大多數(shù)大腦的神經(jīng)元小樣本（來自7例AD的29個神經(jīng)元和13個神經(jīng)典型對照組的40個神經(jīng)元）進行了基于PTA的scWGS，并確認AD神經(jīng)元與對照組相比包含更多的改變，PTA檢測到的sSNVs代表雙鏈體細胞突變。
PTA檢測到的突變，這再次證實了簽名A突變以時鐘般的方式隨著年齡的增長而增加，AD神經(jīng)元中的簽名A略有顯著增加（P = 0.04，線性混合模型）。AD神經(jīng)元總突變的增加一樣，PTA突變特征發(fā)現(xiàn)反映了MDA放大神經(jīng)元基因組的趨勢。其中包括SBS8和SBS30，它們與DNA修復酶NTHL1有關，NTHL1參與氧化性病變修復。轉錄區(qū)域PTA檢測到的sSNVs負荷與大腦中的基因表達水平相關，而簽名A和C突變顯示的模式與MDA檢測到的sSNV相似，指出轉錄活動對突變發(fā)生的特殊影響。因此，兩種scWGS方法都確定了類似的模式，并表明AD中的致病突變機制包括DNA氧化、NER DNA修復和轉錄活性。
圖4. PTA對單個AD神經(jīng)元的體細胞突變分析
總結
兩種不同的單細胞全基因組測序技術揭示了AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過了僅因衰老而發(fā)生的水平，未來探索更多的體細胞突變模式解釋這些氧化性病變?nèi)绾瓮ㄟ^與衰老過程中發(fā)生的突變相互作用來損害基因組功能。
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參考文獻
Miller MB, Huang AY, Kim J, et.al. Somatic genomic changes in single Alzheimer’s disease neurons. Nature. 2022 Apr;604(7907):714-722. doi: 10.1038/s41586-022-04640-1.
文章題目：T-cell dysfunction in the glioblastoma microenvironment is mediated by myeloid cells releasing interleukin-10
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：17.694
研究背景
膠質(zhì)母細胞瘤是一種起源于腦部膠質(zhì)細胞的、顱內(nèi)常見的惡性腫瘤，膠質(zhì)母細胞瘤通常發(fā)生于成人，其累及大腦的頻率高于脊髓。膠質(zhì)母細胞瘤有時也稱為多形性膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）或IV級星形細胞瘤。由于膠質(zhì)母細胞瘤誘導表型發(fā)生變化后，腫瘤細胞與正常細胞相互作用，促進腫瘤細胞生長，浸潤腦組織、抑制免疫反應和誘導血管再生。同時腫瘤細胞還能夠改變內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元等正常腦細胞，形成有利于腫瘤生長的微環(huán)境，導致腫瘤細胞快速生長，并對治療產(chǎn)生抗性。
今天分享一篇2022年3月發(fā)表在Nature Communications上的一篇名為“T-cell dysfunction in the glioblastoma microenvironment is mediated by myeloid cells releasing interleukin-10”的文章，這篇文章中作者通過單細胞轉錄組測序與空間轉錄組測序相結合的方法，發(fā)現(xiàn)了髓系細胞分泌的白介素-10（IL-10）驅(qū)動膠質(zhì)母細胞瘤微環(huán)境中的T細胞功能障礙，最后導致腫瘤細胞生長，以及抑制免疫反應。
實驗設計
髓樣細胞分泌IL-10驅(qū)動T細胞耗竭
該團隊對?8?名診斷為新發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤的患者腫瘤組織樣本進行了單細胞測序和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)“S1”狀態(tài)與?T?細胞耗竭/功能障礙標志物（HAVCR2、CTLA4?和?PDCD1）的表達增加，為了確定與?T?細胞耗竭相關的轉錄途徑，進行了通路信號傳導推斷，揭?示了?T?細胞耗竭與?IL-10?以及部分?TGF??反應之間存在著相關性。
T?細胞中?IL-10?下游信號傳導通路反應的擾動模擬驗證
該團隊通過擾動模擬，用IL-10刺激所產(chǎn)生scRNA-seq數(shù)據(jù)集富集分析推斷常見轉錄因子結合位點，發(fā)現(xiàn)ChiP-seq數(shù)據(jù)中基因BLIMP-1和IRF1峰之間密切重疊，IRF1和PRDM1/14結合位點的顯著富集，提出了“IL10-STAT3-BLIMP-1信號軸可能是腫瘤相關T細胞耗竭的潛在驅(qū)動因素”的假設。為了進一步驗證猜想，作者對PRDM1進行了計算機擾動模擬驗證，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤母細胞瘤微環(huán)境中髓樣細胞分泌IL-10驅(qū)動誘發(fā)T?細胞耗竭。
空間轉錄組測序確定T?細胞的空間分布
為了確定?T?細胞簇的空間位置信息，以及與特定腫瘤狀態(tài)共定位信息，作者進行了空間分辨轉錄組RNA測序(stRNAseq)。該團隊收集3名原發(fā)性GBM IDH1/2 Wt患者組織樣本，數(shù)據(jù)集總共包含2352個測序點，每個點的中位數(shù)為8個細胞（范圍：每個spot點捕獲4~22個細胞）。作者通過NMF回歸和Moran統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞簇與GBM亞型相關聯(lián)，腫瘤區(qū)域富集為間充質(zhì)樣腫瘤（MES樣），星形膠質(zhì)細胞樣（AC樣）轉錄特征與活化的CD8+效應子、CD8+T耗盡簇共定位。
總之，這篇文章中作者通過單細胞轉錄組測序、空間轉錄組測序、擾動模擬等手段，驗證了空間上定位于膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）間充質(zhì)樣亞群中的髓樣細胞分泌IL-10驅(qū)動T細胞耗竭，導致抑制性免疫微環(huán)境，促進腫瘤進展。這些研究成果對于臨床治療膠質(zhì)母細胞瘤疾病提供了新的治療方案。除此之外，單細胞轉錄組測序&空間轉錄組測序技術在該研究中，起到了關鍵性作用。
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文章：Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells
期刊：Nature
影響因子：49.962
研究背景
結腸癌（CRC）是胃腸道中常見的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著癌腫的增大而表現(xiàn)出便血、腹瀉、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)貧血、體重減輕等全身癥狀。其發(fā)病率和病死率是僅次于肺癌的第三種惡性腫瘤疾病。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國大約有20%患者被診斷出結直腸癌時，已經(jīng)處于癌癥晚期了，且結腸癌死亡的主要原因是腫瘤轉移和疾病復發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)預測CRC疾病復發(fā)高風險的基因由腫瘤微環(huán)境(TME)的細胞表達，特別是癌癥相關成纖維細胞(CAF)表達。因此，消除相關腫瘤細胞表達并預防結直腸癌復發(fā)，是目前臨床診斷研究比較炙熱的關注點。2022年11月9日，來自西班牙巴塞羅那科學技術研究所的研究人員在Nature上一篇名為“Metastatic recurrence in colorectal cancer arises from residual EMP1+ cells”的文章，該文首次發(fā)現(xiàn)了隱藏在肝臟和肺部中的殘余腫瘤細胞，并描述了它們?nèi)绾窝葑優(yōu)檫@些器官中出現(xiàn)的轉移瘤。
實驗設計
確定高復發(fā)細胞(HRCs)
該團隊通過單細胞轉錄組測序(scRNA-seq）手段，首先對CRC患者樣本進行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)不良預后基因是由一群獨特的腫瘤細胞（包括：CAFs、內(nèi)皮細胞以及較小程度上髓系細胞）表達的，該團隊將其命名為高復發(fā)細胞（high-relapsecells，HRCs）。
接著研究團隊建立了CRC小鼠模型，模擬手術切除原發(fā)腫瘤后發(fā)生轉移性復發(fā)的過程。發(fā)現(xiàn)原發(fā)性CRC手術后，小鼠肝臟中殘留的HRCs的增殖活動很少，對原發(fā)性結腸癌的生長沒有貢獻。但隨著時間的推移，殘留的HRCs會產(chǎn)生多種細胞類型，包括LGR5干細胞樣腫瘤細胞。這群HRC細胞能夠脫離原發(fā)性結腸癌，遷移到血液中，到達肝臟，并在手術后隱藏一段時間，隨后引發(fā)明顯的腫瘤轉移。
殘留的EMP1+細胞導致腫瘤復發(fā)
為了找到結直腸癌的轉移性復發(fā)的真正來源，研究人員借助人和小鼠模型，借助單細胞轉錄組測序技術(scRNA-seq），發(fā)現(xiàn)EMP1在 HRCs細胞中高表達，且與EpiHR基因的表達有很大的重疊。進一步通過細胞消融實驗，證明了導致腫瘤復發(fā)來源于殘留的EMP1陽性細胞。
總之，這些研究成果對于臨床治療結直腸癌疾病提供了新的治療方案，這種新型的輔助免疫治療可預防結直腸癌轉移性復發(fā)。除此之外，單細胞轉錄組測序技術在該研究中，對腫瘤微環(huán)境、腫瘤細胞之間異質(zhì)性、細胞亞型及狀態(tài)等研究方面，起到了關鍵性作用。
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標題：Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM
發(fā)表雜志：EBioMedicine（IF=11.205）
發(fā)表時間：202209
研究背景
膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是具有侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤類型，通常對目前的治療具有耐藥性，以腫瘤微環(huán)境為中心的療法可能為GBM治療帶來新的希望。因此，迫切需要深入了解腫瘤-基質(zhì)通訊，以確定有希望的治療靶點。
研究方案設計
1、收集人、小鼠GBM的單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)、RNA-seq數(shù)據(jù)和空間轉錄組（Spatial transcriptomics，ST）數(shù)據(jù)；
2、免疫細胞分選
1）小鼠脾臟T cells：EasySep Mouse T Cell Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19851) ；
2）單核細胞：RPMI-1640 medium (Life Technologies, 11875119)沖洗股骨和脛骨，40μm濾器過濾，EasySep Mouse Monocytes Isolation Kit (Stemcell Technologies; 19861)分選.；
3）CD11b+F4/80+GPNMB+ macrophages and CD11c+MHCII+ dendritic cells：anti-CD45 (1:200, eBioscience), anti-CD11b (1:200, eBioscience), anti-CD11c(1:200, BioLegend), anti-F4/80 (1:200, BioLegend), anti-MHCII (1:200, eBioscience) and anti-GPNMB (1:100, Invitrogen)。
3、流式分選：小鼠GBM細胞懸液抗體孵育30 mins，anti-CD45 (1:200, eBioscience)、anti-CD3 (1:100, BioLegend)、anti-CD11b (1:200, BioLegend)、anti-CD11c (1:200, BioLegend)、anti-F4/80 (1:200, BioLegend)、anti-MHCII (1:200, eBioscience) 、IgG antibodies對照；
4、免疫熒光：anti-GPNMB (1:50, R&D Systems)、anti-Mac-3 (1:100, BD)、anti-CD3(1:100, Abcam) 。
5、細胞共培養(yǎng)：前神經(jīng)元型膠質(zhì)瘤細胞和新鮮分離的CD11b+ F4/80+巨噬細胞，每三天加入新鮮的巨噬細胞，持續(xù)的刺激后檢測間充質(zhì)表型的三種主要轉錄因子的表達（EPAS1、CEBPB、FOSL2）。
數(shù)據(jù)分析方法
1、scRNA-seq數(shù)據(jù)處理：Seurat，低質(zhì)量細胞過濾（a cutoff value of less than 200 total feature RNA and more than 5% mitochondrial RNA）、SCTransform標準化、PCA降維（npcs=30）、細胞類群識別FindNeighbors and FindClusters（resolution=0.8）、差異分析FindAllMarkers function (cutoff:min.pct=0.25 and logfc.threshold=0.25)；
2、ST數(shù)據(jù)處理：Seurat 4.0，SCTransform標準化、 PCA and UMAP降維聚類（npcs=30）、SpatialFeaturePlot空間可視化；
3、腫瘤拷貝數(shù)據(jù)變異：inferCNV，過濾expressed less than 10 cells and a median expression below 0.1；
4、細胞軌跡分析：Monocle 2，過濾expression was less than 0.5 and expressed cells were fewer than 200；
5、轉錄因子活性：SCIENCE，相關性GENIE3 (treeMethod= ”RF”, K=”sqrt”, nTrees?=?1000)
6、細胞通訊：Nichenet（Only the top 15% expressed genes in sender cells were calculated by regulatory potentials and ligand activity was ranked with a cutoff of 0.5 using Pearson test）、CytoTalk（分析T cells、 dendritic cells、Gpnmb-high macrophages、monocytes）
研究思路
研究結果
1、scRNA-seq分析GBM腫瘤異質(zhì)性圖譜
利用Seurat整合分析了來自不同數(shù)據(jù)集的scRNA-seq數(shù)據(jù)（GSE103224、GSE138794、GSE139448和GSE131928），共獲得來自40例患者的54,534個細胞（圖1a）；利用inferCNV分析進一步鑒別腫瘤細胞和正常細胞（圖1），與已發(fā)表的WES 數(shù)據(jù)一致；鑒定注釋到的惡性細胞包括：MES-like細胞（12.2%，CHI3L1、ADM）、AC-like細胞（36%，MLC1、HOPX）、NPC-like細胞（4.9%，CD24、DCX）和OPC-like細胞（26.4%，PDGFRA、OLIG1），非腫瘤細胞包括：巨噬細胞（8.2%，CD163、CD68）、小膠質(zhì)細胞（1.5%，CX3CR1、TMEM119）、淋巴細胞（0.7%，CD3D、NKG7）、內(nèi)皮細胞（1.1%，VWF、PECAM1）、腫瘤相關內(nèi)皮細胞（0.8%，COL1A2、BGN）、少突膠質(zhì)細胞（4.3%，PTGDS、MBP）（圖1c-d）；GBM患者表現(xiàn)出高水平的瘤內(nèi)異質(zhì)性，尤其是腫瘤細胞（圖1E-F）；GSEA分析也驗證了GBM的不同腫瘤細胞亞型（圖1g）。
圖1 scRNA-seq分析GBM腫瘤異質(zhì)性圖譜
2、軌跡分析揭示前神經(jīng)元-間充質(zhì)亞型轉換中的關鍵轉錄調(diào)節(jié)因子
利用細胞軌跡分析，探索GBM不同腫瘤亞型間的分化關系，結果顯示擬時間線上主要由NPC-和OPC-like 腫瘤細胞逐漸分化為AC-和MES-like腫瘤細胞，同時有個小分支為AC-like腫瘤細胞，揭示了GBM的可塑性和前神經(jīng)元型（proneural, PN）到間質(zhì)型（mesenchymal, MES）的動態(tài)過渡（圖2a-c）；PN與細胞周期、G2M檢查點和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化相關的通路顯著富集，表明PN具有高度增殖性和可塑性，而MES與上皮-間充質(zhì)轉化（EMT）、缺氧、ECM組織和細胞粘附相關的通路顯著富集（圖2d）；利用TCGA數(shù)據(jù)集進行生存分析，結果顯示，與PN組相比，具有MES-like轉錄組特征的患者總生存期較差，而與MES-low組相比，MES-high組預后更差，表明具有間充質(zhì)特征的GBM患者的生存結局較差（圖2e）。Tips：利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床數(shù)據(jù)，將單細胞數(shù)據(jù)中鑒定到關鍵maker基因或基因集進行生存分析，是探討臨床意義的有效途徑。
利用SCENIC分析PN或MES細胞中的關鍵轉錄調(diào)控網(wǎng)絡，結果顯示，轉錄因子E2F1、SOX9、RARA、SOX11和SOX4在OPC和NPC細胞中差異過表達，而 EAPS1、CEBPB、FOSL2、STAT2和EGR1在MES和AC細胞狀態(tài)中差異過表達，細胞軌跡分析證實了PN-MES轉換過程中EPAS1、CEBPB和FOSL2的激活以及SOX4、SOX11的下調(diào)（圖2k）。以上結果突出了從PN到MES細胞狀態(tài)的動態(tài)轉變主要是由關鍵轉錄因子驅(qū)動的。
圖2 軌跡分析揭示前神經(jīng)元-間充質(zhì)亞型轉換中的關鍵轉錄調(diào)節(jié)因子
3、PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析
利用MES基因特征將患者分為MES-high和MES-low組，發(fā)現(xiàn)MES-high組腫瘤微環(huán)境中伴有豐富的巨噬細胞、T細胞和內(nèi)皮細胞浸潤（圖3a, b）；但T細胞浸潤在很多癌種的研究中與患者預后呈正相關，因此利用TCGA數(shù)據(jù)進一步分析，GBM MES亞型表達更高的T細胞和髓系細胞標志物，并且T細胞與巨噬細胞存在很強的相關性（圖3c-d）；對空間scRNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)CD8 + T細胞與CD68 +髓系細胞、內(nèi)皮細胞共定位（圖3e），證實了T細胞與髓系細胞之間存在空間上的緊密接觸，可能發(fā)生在血管微環(huán)境中（vascular niches）。Tips：每個實驗組增加ST樣本，不僅能與單細胞數(shù)據(jù)互相驗證，還能對maker基因和細胞類型進行空間定位，精準鎖定有真實空間物理接觸的細胞間互作關系。
利用反卷積算法對TCGA數(shù)據(jù)進一步進行分析，發(fā)現(xiàn)T細胞豐度與巨噬細胞、樹突狀細胞顯著相關，這是兩個主要的髓系細胞（圖3f）；利用流式細胞術，分析小鼠GBM中的免疫細胞，證實了T細胞與CD11b + F480 +腫瘤相關巨噬細胞（TAM）或CD11c + MHCII + DC顯著正相關（圖3g）。因此，間充質(zhì)亞型中T細胞比例較高主要是由于巨噬細胞的浸潤。
圖3 PN-和MES-GBM的腫瘤免疫微環(huán)境解析
4、源自巨噬細胞的GPNMB有助于PN-MES細胞狀態(tài)轉變
利用NicheNet分析腫瘤微環(huán)境中的細胞間信號通訊，鑒定到了多個基質(zhì)細胞-腫瘤細胞相互調(diào)控的配體-受體對，其中預測到巨噬細胞高表達的GPNMB與大多數(shù)間充質(zhì)靶標存在相互作用（圖4a），GPNMB是一種跨膜糖蛋白，最初是在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)的，參與腫瘤遷移、侵襲、轉移，通過直接抑制T細胞活化來逃避免疫；Tips：基于個性化分析結果，優(yōu)先篩選TOP基因（顯著性、差異倍數(shù)、靶標基因數(shù)目等），結合研究領域內(nèi)已有特定功能報道的基因或通路，可以幫助更快鎖定目標分子。
HPA和TCGA數(shù)據(jù)分析結果顯示，GPNMB主要在巨噬細胞中表達，并且與巨噬細胞標志物顯著正相關，這表明巨噬細胞是GPNMB的主要來源（圖4b, c），流式細胞術結果證實了GPNMB主要在巨噬細胞上表達，而不是樹突狀或腫瘤細胞。Tips：流式細胞術是單細胞測序常見的下游驗證方法，可用來分選目標細胞類群、驗證細胞比例的變化和新鑒定的maker基因作為特定細胞分選的可行性等。
GPNMB在MES亞型患者中高表達，并且與低級別和高級別膠質(zhì)瘤的預后不良相關（圖4d, e）；推測高表達GPNMB的巨噬細胞可以誘導腫瘤細胞向MES表型轉變，進一步利用細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)來驗證這一假設，結果表明，長期接觸巨噬細胞可以誘導腫瘤細胞中間充質(zhì)轉錄因子的表達，并且靶向GPNMB的中和抗體治療可以部分消除這種作用，表明GPNMB是PN-MES狀態(tài)過渡的重要調(diào)節(jié)因子（圖4f）。
圖4 源自巨噬細胞的GPNMB有助于PN-MES細胞狀態(tài)轉變
5、小鼠scRNA-seq分析單核細胞分化為Gpnmb-high巨噬細胞
收集小鼠GBM scRNA-seq數(shù)據(jù)，重點關注在早期（d7）和晚期（d28）GBM小鼠的CD45 +免疫細胞。根據(jù)細胞maker基因表達鑒定到了NK cells、Cd8+ T cells、Cd4+ T cells、 B cells、neutrophils、cDC1、cDC2、pDC、mDC、monocytes、TAM、monocytes/TAM、microglia cells（圖5a）；與以往的報道類似，巨噬細胞隨著腫瘤進展急劇侵入腫瘤部位，而小膠質(zhì)細胞在腫瘤發(fā)展過程中逐漸消失（圖5b）；細胞軌跡分析推斷出樹突狀細胞和巨噬細胞起源于單核細胞，并隨著腫瘤進展而逐漸分化（圖5c）；不同的通路主導了腫瘤浸潤T細胞的募集，單核細胞主要表達Cxcl10、Cxcl9、樹突狀細胞特異性表達Ccl17、Ccl22，而巨噬細胞表達Ccl24，Saa3、Arg1和Gpnmb僅在巨噬細胞中出現(xiàn)(圖5d）；在腫瘤發(fā)生過程中，Arg1和Gpnmb的表達在巨噬細胞中被強烈誘導（圖5e-g），這與人GBM數(shù)據(jù)集中的發(fā)現(xiàn)一致；然而，Gpnmb敲低后CD206（經(jīng)典M2巨噬細胞標志物）表達不變，提示GPNMB不是M2巨噬細胞極化的驅(qū)動因素；免疫熒光染色顯示GPNMB+巨噬細胞與T細胞共定位（圖5h），表明它們之間存在潛在的相互作用。
圖5 小鼠scRNA-seq分析單核細胞分化為Gpnmb-high巨噬細胞
6、GPNMB-high巨噬細胞影響DC激活T細胞
利用CytoTalk算法分析GBM中T細胞與APC-like細胞間的相互作用，研究完整的信號轉導途徑，結果顯示，T細胞通過Chemokines、cytokines、co-stimulatory/inhibitory、antigen-presentation通路與單核細胞、Gpnmb-high巨噬細胞、樹突狀細胞相互作用，并且DC細胞與Gpnmb-high巨噬細胞共享Cxcl16-Cxcr6趨化因子信號與T細胞相互作用。為了驗證Gpnmb-high巨噬細胞的調(diào)控機制，從GBM腫瘤和正常小鼠中提取F4/80 + GPNMB +巨噬細胞、D11c + DC和骨髓來源的單核細胞，然后與na?ve T細胞共培養(yǎng)（圖6e）；實驗結果顯示，與GPNMB+巨噬細胞和單核細胞相比，CD11c + DC共培養(yǎng)表達更高水平的CD69、IFNγ和GZMB，能更好地誘導T細胞活化（圖6f）；T細胞增殖實驗檢測結果也表明，與GPNMB+巨噬細胞和單核細胞相比，CD11c + DC能顯著促進T細胞增殖（圖6g）。綜合以上結果，確定了關鍵的GPNMB-high巨噬細胞亞群是GBM細胞間通訊的樞紐，不僅誘導PN-MES腫瘤細胞轉化，而且通過與DC競爭而損害T細胞激活。Tips：利用細胞通訊分析篩選潛在細胞間互作的受體-配體對，結合細胞共培養(yǎng)、co-IP和免疫熒光等實驗，可以探究目標細胞類型對特定細胞功能的影響及機制。
圖6 GPNMB-high巨噬細胞影響DC激活T細胞
研究總結
1、本文通過scRNA-seq數(shù)據(jù)將高度異質(zhì)性的GBM腫瘤細胞分為MES-like、AC-like，OPC-like和NPC-like亞型；
2、利用細胞軌跡分析和轉錄調(diào)控網(wǎng)絡分析預測到由特定TF調(diào)節(jié)的PN到MES細胞狀態(tài)轉換；
3、利用空間轉錄組數(shù)據(jù)、TCGA數(shù)據(jù)庫、細胞通訊分析，鎖定到了關鍵的GPNMB-high巨噬細胞，在PN-MES細胞狀態(tài)轉變中發(fā)揮重要作用；
4、通過信號轉導分析和細胞共培養(yǎng)研究，進一步揭示了這些源自單核細胞的GPNMB高巨噬細胞亞群可能無效地保留T細胞不被樹突狀細胞激活，提示未來靶向GPNMB-high巨噬細胞的聯(lián)合免疫治療可作為有潛力的治療策略。
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參考文獻
Xiong A, Zhang J, Chen Y, Zhang Y, Yang F. Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM. EBioMedicine. 2022;83:104239. doi:10.1016/j.ebiom.2022.104239
單細胞測序數(shù)據(jù)挖掘方向
| 數(shù)據(jù)處理? | 細胞分群注釋? | 差異分析? | 功能分析? | 細胞通訊分析? |
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| 發(fā)育軌跡分析? | 轉錄調(diào)控分析? | 腫瘤異質(zhì)性分析? | 臨床相關性分析? | 單細胞聯(lián)合空間? |
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單細胞測序數(shù)據(jù)個性化分析方法
單細胞測序數(shù)據(jù)的挖掘方向復雜多樣，針對不同領域的生物學表型和機理研究，需要持續(xù)不斷地開發(fā)個性化分析內(nèi)容，從不同的角度進行個性化數(shù)據(jù)挖掘，以下就是單細胞測序數(shù)據(jù)個性化分析的幾個分析方向：
1、單細胞測序個性化分析方法：細胞軌跡分析–揭示細胞發(fā)育分化動態(tài)軌跡
細胞軌跡分析可以在單細胞分辨率驗證已知的細胞分化關系，推斷未知的細胞分化路徑，挖掘一些稀少的中間狀態(tài)細胞，解析細胞分化過程中的起調(diào)控作用的關鍵基因，在發(fā)育生物學中細胞分化、譜系發(fā)育研究方向、腫瘤/疾病微環(huán)境中免疫細胞的動態(tài)變化研究中均有廣泛應用。目前進行細胞軌跡分析的方法和軟件非常之多，大致可以概括為兩種方法，一種是以monocle軟件為代表的擬時序分析（pseudotime analysis），另一種則是以velocyto /scVelo為主的RNA速度分析（RNA velocity）。詳情>>單細胞數(shù)據(jù)分析沒有思路？試試細胞軌跡分析~(內(nèi)附代碼)
2、單細胞測序個性化分析方法：細胞通訊分析–解析細胞間的信號通訊關系
多細胞生物是由很多不同類型細胞組成的開放而復雜體系，配體受體復合物介導的細胞間通訊對協(xié)調(diào)發(fā)育、分化和炎癥等多種生物學過程至關重要。細胞通訊分析，又稱細胞受體-配體互作分析，是以細胞亞群的基因表達量數(shù)據(jù)為研究對象，通過獲得細胞中配體及受體基因的表達信息，比較細胞類型之間的配體與受體基因表達差異，分析得到細胞亞群間的信號通訊關系，在闡明生物學過程中細胞間通訊的復雜性、多樣性和動態(tài)性方面有重要意義。
3、單細胞測序個性化分析方法：GSEA/GSVA分析–基于功能基因集的富集分析策略
GSEA( Gene Set Enrichment Analysis)，是2005年由Broad Institute研究開發(fā)的一種基于基因集的富集分析方法，用來評估一個預先定義的基因集的基因在與表型相關度排序的基因表中的分布趨勢，從而判斷其對表型的貢獻。GSEA是從所有基因的表達豐度出發(fā)，分析在不同的通路中的基因的整體表達影響，這也是區(qū)別于GO/KEGG富集分析的地方，GSEA不需要設定差異閾值篩選目標基因集，理論上更容易囊括細微但協(xié)調(diào)性的變化對生物通路的影響。Broad研究所在GSEA發(fā)布8年之后，開發(fā)了GSVA（Gene Set Variation Analysis）算法來拓展基因集分析的應用。GSEA分析主要用于兩兩組間比較的方案設計中，對于分組比較復雜的方案設計則比較適合GSVA分析，GSVA不需要預先進行樣本之間的差異分析，依據(jù)表達矩陣就可以計算每個樣本中特定基因集的變異分數(shù)。
4、單細胞測序個性化分析方法：腫瘤拷貝數(shù)變異分析–揭示惡性細胞表型
拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)是由基因組發(fā)生重排而導致的，基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，基因組結構變異(Structural variation, SV) 的重要組成部分，也是人類疾病的重要致病因素之一。與正常細胞相比，腫瘤基因組部分區(qū)域呈現(xiàn)過表達或低表達狀態(tài)，通過與一組參考的“正?！奔毎啾龋容^不同樣本間或不同細胞類型之間的CNV基因表達差異，探索腫瘤基因組位置上基因的表達強度，最終反映基因大片段區(qū)域的CNV事件，鑒定體細胞整個染色體或大片段染色體的擴增或缺失。
5、單細胞測序個性化分析方法：轉錄因子活性分析–挖掘關鍵調(diào)控轉錄因子
單細胞研究通常會涉及到一個核心關鍵問題：細胞的異質(zhì)性以及這種異質(zhì)性是如何發(fā)展和維持的。這種細胞異質(zhì)性很大程度上是由潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡決定的，特定轉錄因子（transcription factor，TF）集合的協(xié)同表達驅(qū)動各自靶標基因的表達，從而建立特定的基因表達譜。因此，單細胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡對于深入挖掘細胞異質(zhì)性背后的生物學意義是至關重要的。利用pySCENIC從單細胞轉錄組數(shù)據(jù)中推斷TF、基因調(diào)控網(wǎng)絡和細胞類型，基本原理是基于共表達和DNA調(diào)控保守序列（motif）分析推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡，然后在每個細胞中分析網(wǎng)絡活性以鑒定細胞狀態(tài)。
6:、單細胞測序個性化分析方法：加權基因共表達網(wǎng)絡分析–篩選表型相關核心調(diào)控網(wǎng)絡
加權基因共表達網(wǎng)絡分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）是構建基因共表達網(wǎng)絡的常用方法，可以探索模塊與特定表型或疾病的關聯(lián)關系,最終達到鑒定基因網(wǎng)絡的目的；單細胞測序技術可以揭示特定腫瘤組織中的細胞特異性，對細胞進行分類，并且識別特定的標志物，但其檢測的細胞數(shù)量和病例來源都是有限的。利用WGCNA分析單細胞轉錄組測序數(shù)據(jù)，可以提供一套有別于高変基因、差異分析的方法，不依賴于數(shù)據(jù)庫直接用表達量的相關性值預測調(diào)控關系，篩選某些細胞亞群中有關聯(lián)作用的基因集（稱為模塊），可以從成千上萬的基因中挑選出高度相關的基因的模塊，并將模塊與表型進行關聯(lián)，尋找marker gene或治療靶點。
7、單細胞測序個性化分析方法：單細胞空間聯(lián)合分析-解析空間結構異質(zhì)性
基因表達具有時間和空間特異性，單細胞轉錄組主要從時間上研究基因表達，能夠系統(tǒng)的識別組織中的細胞亞群，但沒有捕獲其空間組織信息，限制了我們對組織及細胞間相互作用的理解。而空間轉錄組的應用使得人們能夠從空間的角度解析數(shù)據(jù)，在空間上研究基因的表達。通過整合兩種數(shù)據(jù)模式，將單細胞轉錄組數(shù)據(jù)和空間轉錄組數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，在時空上分析基因的表達具有重要的意義。
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發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表單位：柏林醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究所
影響因子：41.307
發(fā)表時間：2022.07.21
DOI號：10.1038/s41588-022-01129-5
研究背景
成年哺乳動物的心臟損傷通常會導致永久性瘢痕。然而，成年斑馬魚心臟損傷后能有效再生，這使得斑馬魚成為研究心臟再生細胞和分子機制的理想模型。在模擬心肌梗塞的低溫損傷后，受傷的斑馬魚心臟會經(jīng)歷一個短暫的纖維化期。在此期間，受損的心肌會通過去分化和增殖進行再生，這與心肌梗死的某些方面相似。然而，在以往的斑馬魚心臟再生研究中，還沒有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)來確定再生細胞的狀態(tài)和細胞類型的起源，對再生生態(tài)位的細胞組成、潛在的信號傳遞和相互作用的認識仍不全面。目前對活化巨噬細胞和成纖維細胞的定義嚴重依賴于轉基因，可能受到觀察偏差的影響，從而低估斑馬魚心臟再生過程中細胞狀態(tài)的復雜性。
材料方法
單細胞RNA-seq ：
表1 實驗樣本一覽表
空間轉錄組（Tomo-seq）：斑馬魚心房和心室一共100張切片，每張切片分別做RNA-seq
方法：scRNA-seq、Tomo-seq、熒光原位雜交和基于CRISPR-Cas9技術的譜系追蹤
研究結果
為了系統(tǒng)地識別健康和再生斑馬魚心臟中的細胞類型，作者對損傷前后不同階段的大約20萬個解離細胞進行了scRNA-seq（圖1a）。為了準確得到細胞發(fā)育起源的相關信息，作者還應用了一種基于CRISPR–Cas9技術的大規(guī)模平行譜系追蹤方法，通過注射Cas9和針對多拷貝轉基因(斑馬魚系中的dTomato：一種用于斑馬魚細胞追蹤和譜系分析的多光譜細胞標記)的sgRNA，創(chuàng)建了作為譜系條形碼的“遺傳疤痕”來記錄早期發(fā)育中的譜系關系。
作者首先評估了健康和再生心臟中的細胞類型多樣性，單細胞轉錄組的聚類分析顯示了所有主要的心臟細胞類型。正如預期的那樣，觀察到成纖維細胞和免疫細胞在損傷后強烈增加（圖1b）。進一步檢查聚類數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，心臟的三個主要層:心外膜、心肌和心內(nèi)膜的細胞類型之間存在一個亞結構。作者假設，由于心房和心室中這些細胞類型的功能差別，這種細胞類型的亞結構可能存在空間差異。于是使用Tomo-seq方法（一種用冷凍切片機沿感興趣的軸對組織進行切片，然后在每個切片上進行RNA-seq的技術）進行空間分辨率轉錄組，并將空間數(shù)據(jù)解卷積為單細胞轉錄譜，可以驗證一些細胞亞型在心房和心室富集（圖1c）。之后再通過物理分離心房和心室，使用scRNA-seq證實了這一發(fā)現(xiàn)（圖1d）。
圖1?再生心臟的細胞組成
作者進一步確定了心肌細胞中的一個轉錄亞結構（圖2a）。除了以表達ATP合成和三羧酸循環(huán)相關基因(atp5pd和aldoaa)為特征的成年心肌細胞外，還檢測到一個較小的與心肌細胞發(fā)育相關的基因簇(ttn.1, ttn.2,?bves and synpo2lb)，以及nppa——此前已被證明是邊界區(qū)去分化心肌細胞的標記基因。這些去分化心肌細胞是心臟再生的標志，其數(shù)量在3 d.p.i.（受傷后天數(shù)）增加了(圖2a)，并與已建立的標記基因nppa22部分共定位于7 d.p.i.。
作者注意到心臟再生中三個成熟的信號因子在成纖維細胞中高度富集:合成視黃酸的酶aldh1a2、心肌細胞有絲分裂原nrg1和再生細胞外基質(zhì)(ECM)因子fn1a（圖2b）。為了更詳細地研究心臟成纖維細胞的多樣性，作者對成纖維細胞進行了亞群聚類。結果顯示出驚人的多樣性，有13個轉錄上不同的成纖維細胞聚類(圖2c)。這13個基因簇在ECM相關基因的表達譜上表現(xiàn)出明顯的差異（圖2d），但它們的轉錄組多樣性遠不止于此——去除ECM相關基因后，可以高精度鑒定相同的成纖維細胞亞型。
圖2?心臟成纖維細胞的細胞類型多樣性
3. 心臟再生成纖維細胞的鑒定
為了集中分析那些可能是再生生態(tài)位一部分的成纖維細胞亞型，作者分析了損傷后細胞簇的動力學。col11a1a、col12a1a和nppc特征表達的3簇成纖維細胞在再生高峰期短暫出現(xiàn)?(3、 7 d.p.i.)，但在受傷前和再生完成后幾乎不存在。由于其短暫性，作者將這三個基因簇稱為細胞狀態(tài)，而不是細胞類型（圖3a）。為了對鑒定的成纖維細胞進行空間分辨，作者進行了熒光原位雜交證實了瞬時成纖維細胞狀態(tài)在邊界區(qū)以及損傷區(qū)的位置（圖3b）。之后發(fā)現(xiàn)nrg1在col12a1a成纖維細胞中特別高的表達，而fn1a幾乎只在col11a1a成纖維細胞中表達（圖3c）。作者推斷瞬時細胞狀態(tài)的潛在再生功能可能是由分泌因子驅(qū)動的。生物信息學分析顯示，與未損傷的對照組心臟相比，再生心臟的分泌組基因表達在3 d.p.i.和7 d.p.i.時增加（圖3d）。col11a1a和col12a1a成纖維細胞中分泌組基因的表達在所有檢測到的細胞簇中最高，且其分泌組基因包含在再生、形態(tài)發(fā)生和組織發(fā)育等方面具有功能的基因（圖3e）。
雖然作者對單細胞基因表達譜的時空分析強烈表明了瞬時成纖維細胞的再生功能，但還需要額外的實驗來驗證這一假設。為了從功能上評估瞬時col11a1a和col12a1a成纖維細胞的作用，作者使用硝基還原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系統(tǒng)進行靶向細胞剔除。在MTZ處理后的轉基因系Tg(-4kbcol12a1a:GAL4VP16;UAS:NTR:RFP)中，在7 d.p.i.時相較于對照，5 / 6的心臟顯示心肌細胞增殖減少，col12aa表達細胞減少（圖3g,h）。在30d.p.i.時，col12a1+細胞剔除顯著損害心臟再生（圖3i,j）?？傊?，作者確定了心臟再生過程中具有潛在再生作用的三種成纖維細胞狀態(tài):col11a1a、col12a1a和nppc成纖維細胞。基因細胞剔除數(shù)據(jù)強烈表明col12a1a表達細胞在再生生態(tài)位中發(fā)揮了作用。
圖3?心臟再生成纖維細胞的鑒定
4. 心外膜成纖維細胞的鑒定
接下來，作者想要闡明短暫成纖維細胞狀態(tài)的起源，以便更好地理解它們的激活機制。于是作者使用了基于CRISPR-Cas9技術的大規(guī)模平行譜系追蹤方法LINNAEUS。這種方法將細胞通過可遺傳的DNA條形碼(遺傳疤痕)標記，它們由Cas9在早期發(fā)育過程中產(chǎn)生，其獨特的序列能夠識別疤痕產(chǎn)生時來自同一親本的細胞。通過對同一個單細胞的遺傳疤痕和轉錄組進行測序，作者便可以建立譜系樹，揭示這些細胞類型的共同發(fā)育起源（圖4a）。在譜系樹中，一個節(jié)點中的所有細胞共享相同的發(fā)育祖先（比如圖4a，B和C節(jié)點就共享相同發(fā)育祖先A），并且每個節(jié)點上不同瞬時細胞狀態(tài)下的每個細胞均可在相同的上一節(jié)點中對應找到（比如在圖4a的譜系圖中節(jié)點C就包含了3種瞬時細胞狀態(tài)，這三種狀態(tài)下的所有細胞均可以在上一節(jié)點的對應細胞狀態(tài)中找到）。作者還計算了不同樹節(jié)點中細胞類型比率之間的相關性，以確定哪些細胞類型通過譜系相關聯(lián)（圖4b）。譜系相關性聚類熱圖顯示，在3 d.p.i.時有4簇細胞類型，在7 d.p.i.時有7簇細胞類型。在這兩個時間點，所有的免疫細胞共享一個相同的譜系。此外，幾種成纖維細胞：col11a1a、col12a1a和構成型成纖維細胞，它們和心外膜細胞聚集在一起，這表明這些成纖維細胞與心外膜細胞具有共同的發(fā)育起源（圖4c,d）。為了驗證這一結論，作者又構建了轉基因系TgBAC(tcf21:Cre-ERT2;ubi:Switch)。重組后，在7 d.p.i.表達的mCherry與內(nèi)源性表達的col12a1a共定位（圖4e），證實了瞬時col11a1a和col12a1a成纖維細胞為心外膜或心外膜衍生成纖維細胞的起源。為了進一步闡明短暫心外膜成纖維細胞狀態(tài)的起源，作者應用了RNA速度分析方法，對心外膜譜系簇中所有心室細胞類型在3 d.p.i.和7 d.p.i.下的發(fā)育軌跡進行推斷（圖4f），得到了相同的結論。
圖4?心外膜成纖維細胞的鑒定
5. 心內(nèi)膜成纖維細胞的鑒定
瞬時nppc成纖維細胞和其他幾個成纖維細胞亞型(spock3、cfd和瓣膜成纖維細胞)在3 d.p.i.或7 d.p.i.時不屬于心外膜譜系，但與心內(nèi)膜以及彼此之間顯示中度正相關?；谙嚓P性的分析有一個潛在的假設，即所有克隆體都會表現(xiàn)出相似的轉換率（圖5a），但是這種假設并不適用于所有細胞類型，于是作者引入條件概率開發(fā)了第二種算法（圖5b）。在3 d.p.i.時，不同成纖維細胞類型：col11a1a成纖維細胞、構成型成纖維細胞、心外膜(心室)轉變?yōu)?em>col12a1a成纖維細胞類型的條件概率均大于0.9（圖5c）。在7 d.p.i. 時，不同的心內(nèi)膜細胞類型：心內(nèi)膜（心房）、心內(nèi)膜（心室）和心內(nèi)膜 ( frzb )轉變?yōu)?em>nppc成纖維細胞的條件概率均大于0.8，表明這種成纖維細胞類型與心內(nèi)膜之間存在譜系關系。為了驗證算法的真實性，作者構建了轉基因系Tg(fli1:Cre-ERT2; hsp70l:Switch)。在7 d.p.i.表達的EGFP與內(nèi)源性表達的nppc共定位（圖5e），證實了瞬時nppc成纖維細胞的心內(nèi)膜起源。RNA速度分析揭示了心室內(nèi)膜和nppc成纖維細胞之間的轉錄相似性和潛在的過渡路徑（圖5f）。從單細胞轉錄組數(shù)據(jù)中觀察到，與健康對照組心臟相比，心內(nèi)膜在7 d.p.i.時發(fā)生了激活反應（圖5g）。
圖5?心內(nèi)膜成纖維細胞的鑒定
6. 典型Wnt信號通路作用的細胞解剖
作者發(fā)現(xiàn)成纖維細胞中表達了許多與Wnt信號有關的基因(配體、受體和調(diào)節(jié)劑)（圖6a），于是這啟發(fā)了他們?nèi)パ芯縒nt信號在斑馬魚心臟再生過程中的作用。一方面，Wnt通常被認為是一種促增殖因子，Wnt的激活已被證明對斑馬魚鰭和脊髓再生有益。另一方面，Wnt信號通路在心肌細胞去分化和增殖中的作用存在爭議。于是，作者在斑馬魚心臟冷凍損傷后，使用特征良好的Wnt/β-catenin依賴的信號抑制劑IWR-1抑制典型的Wnt信號，并在3,7,15和30 d.p.i.觀察其影響。結果發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路抑制導致心臟再生顯著延遲，與對照組相比，心肌纖維化延長，損傷面積增大（圖6b）。IWR-1處理后心臟的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)顯示心肌細胞去分化延遲，與對照組相比，去分化心肌細胞數(shù)量在3 d.p.i.時減少，而在7 d.p.i.時未定位于損傷區(qū)域（圖6c）。Wnt抑制后，血管周細胞和所有心內(nèi)膜成纖維細胞(nppc、spock3和瓣膜成纖維細胞)的水平顯著降低，而其他短暫增加的成纖維細胞總體上保持在類似水平（圖6d）。通過熒光原位雜交也證實了，Wnt信號對于心內(nèi)膜成纖維細胞的激活是必需的，類似于所描述的Wnt在誘導小鼠內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉化中的作用。
為了評估血管再生，作者對4d.p.i.下冠脈內(nèi)皮細胞(cECs)的增殖以及7 d.p.i.損傷區(qū)冠狀動脈的覆蓋范圍進行了定量分析。發(fā)現(xiàn)注射IWR-1后，cEC增殖在4 d.p.i.時有邊緣但不顯著的下降（圖6f,g）。然而，在7d.p.i.時，損傷區(qū)冠狀動脈覆蓋明顯減少（圖6h,j）。這些結果表明，Wnt抑制后觀察到的心臟再生減少至少部分是由血管再生缺陷介導的。這種缺陷似乎不是由cECs增殖減少引起的，而可能與血管再生的其他方面有關。
圖6 對典型Wnt信號作用的細胞剖析
總? 結
成年斑馬魚心臟損傷后具有很高的再生能力。然而，再生生態(tài)位的組成在很大程度上仍然難以捉摸。這篇文章基于單細胞轉錄組學和時空分析，解剖了再生斑馬魚心臟中激活細胞狀態(tài)的多樣性。觀察到損傷后出現(xiàn)的幾種具有成纖維細胞特征的瞬時細胞狀態(tài)，并概述了表達膠原-12的成纖維細胞的促再生功能。為了了解導致心臟再生的級聯(lián)事件，作者通過高通量譜系追蹤確定了這些細胞狀態(tài)的起源。最終發(fā)現(xiàn)激活的成纖維細胞有兩個不同的來源:心外膜和心內(nèi)膜。在機制上，確定Wnt信號作為心內(nèi)膜成纖維細胞反應的調(diào)節(jié)器?？傊?，本文確定了促進心臟再生的特殊活化成纖維細胞狀態(tài)，從而為調(diào)節(jié)脊椎動物心臟再生能力開辟了可能的途徑。
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參考文獻
今天跟大家分享一篇少量樣本結合多組學數(shù)據(jù)聯(lián)合分析的研究報道，“彌漫性甲狀腺腫和橋本甲狀腺炎微環(huán)境中免疫細胞基因表達失調(diào)和代謝信號異常的全局調(diào)控網(wǎng)絡”，該文是百邁客合作客戶青島大學醫(yī)學院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院宋西成教授團隊發(fā)表在Frontiers?in?Immunology（IF=8.786）的研究成果，發(fā)表時間為2022年5月。百邁客為該研究提供了單細胞轉錄組、全轉錄組、全長轉錄組和代謝組的建庫測序服務。
研究背景
人類自身免疫性甲狀腺疾病?(AITD)?是最常見的器官特異性自身免疫性疾病，也是甲狀腺功能障礙和非地方性甲狀腺腫的最常見原因，主要表現(xiàn)為彌漫性甲狀腺腫（Graves’disease，GD）和橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s?thyroiditis，HT）；HT和GD具有不同的臨床特征，但它們在組織損傷方面是相似的，包括體內(nèi)淋巴細胞浸潤。研究表明，T淋巴細胞及其特異性細胞因子作為免疫不可或缺的組成部分，在AITD的發(fā)生中起關鍵作用，例如調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)和輔助T細胞17?(Th17)的失調(diào)、Th1/Th2失衡在AITD的發(fā)病機制中起著關鍵作用，但這些細胞亞群免疫功能障礙引起的致病分子機制在很大程度上仍未得到解釋。
本研究基于HT患者、GD患者和健康對照甲狀腺組織的單細胞RNA測序、全轉錄組測序、ONT全長轉錄組測序和代謝組測序數(shù)據(jù)，探討了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達失調(diào)和代謝信號異常的免疫細胞，構建了免疫細胞的全局調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，為進一步了解HT和GD免疫紊亂和代謝異常介導的疾病機制、更好地干預和治療疾病提供了科學的理論指導和研究基礎。
研究思路
主要內(nèi)容
1、全轉錄組測序分析HT和GD的異常表達基因
為了鑒定HT組和GD組中異常表達的lncRNA和miRNA，分別進行了ONT全長轉錄組測序和全轉錄組測序數(shù)據(jù)。差異表達分析結果顯示，共檢測到6,153?個?lncRNA?s和?741?個?miRNAs?在?HT?患者中存在差異表達（圖?1A）；GD患者中檢測到5,492個lncRNAs?和?165?個?miRNAs?存在差異表達（圖?1B）；相關性分析結果驗證了本研究中兩種測序方法的檢測穩(wěn)定性（圖?1C,?D）。
圖1?HT和GD基因表達差異分析
2、HT和GD基因表達差異與異常免疫級聯(lián)和代謝信號傳導有關
對HT組和GD組顯著差異基因進行功能富集分析，結果顯示，HT組中顯著富集的通路為白細胞-細胞粘附、T?細胞活化和分化、細胞因子代謝過程和免疫反應激活的信號轉導（圖?2A），而GD組中，則顯著富集的信號通路為白細胞-細胞粘附、激素代謝過程和的細胞趨化性（圖?2B）；此外，HT（圖?2C）和GD（圖?2D）均富含與甲狀腺疾病相關的信號通路，包括甲狀旁腺激素合成、甲狀腺激素分泌、甲狀腺激素信號通路作用和自身免疫性甲狀腺疾??；同時，HT和GD還富集了其他幾種免疫炎癥和代謝信號相關通路，包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、Th1和Th2細胞分化、NF-kappa?B信號通路、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝和酪氨酸代謝。
為了進一步確定代謝物在HT和GD中的作用，對HT組、GD組及對照組的代謝組數(shù)據(jù)進行差異代謝物分析及代謝通路富集分析（圖?2E,?F）。結果顯示，相較于對照組，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝和類固醇生物合成的代謝通路在HT組中顯著激活（圖?2G(a)），而亞油酸代謝和類固醇激素生物合成代謝通路受到抑制（圖?2G(b)）；此外，類固醇激素生物合成、咖啡因代謝和花生四烯酸代謝通路在GD組中被激活（圖?2G(c)），而苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及亞油酸代謝通路受到抑制（圖?2G(d)）。
鑒于免疫反應在HT和GD中的重要作用，利用GSEA方法進行免疫浸潤分析，進一步評估了樣本中免疫細胞的豐度，發(fā)現(xiàn)CD4?+T細胞、CD8?+?T細胞、巨噬細胞、Th1和Th2細胞均有不同程度的浸潤（圖?2H）。
圖2?HT和GD中失調(diào)的基因表達與異常的免疫級聯(lián)和代謝信號傳導有關
3、HT和GD中疾病微環(huán)境中CD4+?T細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常
對單細胞轉錄組數(shù)據(jù)中的CD4+?T細胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對照組中細胞豐度存在明顯差異（圖?3A）。將bulk?RNA-seq數(shù)據(jù)中顯著差異表達的基因，與CD4+??T細胞的單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)中的基因取交集，并對這些共表達的基因集進行功能富集分析；分析結果顯示，HT組中顯著差異富集的通路有甲狀腺激素信號通路、T?細胞受體信號通路、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、細胞因子-細胞因子受體相互作用和NF-kappa?B信號通路（圖?3B）；而在GD組中，甲狀旁腺激素合成，分泌和作用、ECM-受體相互作用、嘌呤代謝、cAMP?信號通路、NF-kappa?B?信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和T細胞受體信號通路顯著富集（圖?3C?)。GSEA富集分析結果顯示，HT組中細胞因子-細胞因子受體相互作用和T細胞受體信號通路顯著富集（圖?3D），但GD組中未觀察到顯著富集的通路。此外，氨基酸生物合成和嘌呤代謝相關的代謝通路在HT和GD組中均顯著富集。
圖3?HT和GD微環(huán)境CD4+?T細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常
4、HT和GD疾病微環(huán)境中CD8+?T細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常
對單細胞轉錄組數(shù)據(jù)中的CD8+??T細胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對照組中細胞豐度存在明顯差異（圖?4A）；與CD8+?T細胞亞群類似，將與bulk數(shù)據(jù)中共表達的基因集進行功能富集分析。結果顯示，在HT（圖?4B）和GD（圖?4C）中，顯著富集的通路有抗原加工和呈遞、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、細胞因子-細胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號通路；甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用及白細胞跨內(nèi)的遷移途徑在HT組顯著富集；而GD組中，嘌呤代謝和cAMP信號通路顯著富集。GSEA分析結果顯示，HT組中細胞因子-細胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號通路顯著富集（圖?4D），而在GD組中未發(fā)現(xiàn)顯著富集的通路；嘌呤代謝信號通路在HT組和GD組中均富集。
圖4?HT和GD微環(huán)境CD8+?T細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常
5、HT和GD微環(huán)境巨噬細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常
對單細胞轉錄組數(shù)據(jù)中的CD8+?T細胞亞群進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)?HT、GD?和對照組中巨噬細胞豐度存在明顯差異（圖?5A）。同樣地，將與bulk數(shù)據(jù)共表達的基因集進行功能富集分析；分析結果顯示，HT組（圖?5B）和GD組（圖?5C）顯著富集的信號通路有甲狀旁腺激素的合成，分泌和作用、抗原加工和呈遞、Th1和Th2細胞分化、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、NF-kappa?B信號通路和細胞因子-細胞因子受體相互作用；T組中，甲狀腺激素信號通路和Toll樣受體信號通路顯著富集；GD組中，吞噬體、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑顯著富集。GSEA富集分析結果顯示，HT組中細胞因子-細胞因子受體相互作用、NF-kappa?B信號通路、Th1和Th2細胞分化以及Th17細胞分化通路顯著富集（圖?5D)，而GD組中沒有發(fā)現(xiàn)類似的富集通路；嘌呤和苯丙氨酸代謝信號通路分別在HT組和GD組中顯著富集。
圖5?HT和GD微環(huán)境巨噬細胞中基因表達失調(diào)和代謝信號異常
6、HT和GD微環(huán)境中T細胞和巨噬細胞的調(diào)控網(wǎng)絡分析
為了確定HT和GD疾病微環(huán)境的細胞間調(diào)節(jié)機制，對CD4+?T細胞、CD8+?T細胞和巨噬細胞進行iTALK細胞通訊分析。分析結果顯示，HT（圖?6A）和GD（圖?6B）中配體-受體對的豐度存在顯著差異；HT組中，微環(huán)境中的T細胞主要通過IL16-CCR5、FGF10-FGFR1、CXCL13-CXCR3和CD70-CD27受體配體對靶向巨噬細胞，激活細胞因子-細胞因子受體相互作用和T細胞受體信號通路（圖?6C）；GD組中，微環(huán)境T細胞主要通過CXCR3-CXCL10、PKM-CD44和?CCL21-CCR7受體配體對靶向巨噬細胞，激活EMC受體相互作用和NF-kappa?B信號通路（圖?6D）；相較于對照相，調(diào)控網(wǎng)絡中的關鍵基因（CCL21、CCR7、CD4、CD27、CD70、CXCL13、ICOS、IL-16、LAT、TNF及IL16），經(jīng)qPCR實驗驗證，在HT組?(圖?6E?)?和GD?(圖?6F?)均顯示存在顯著差異表達。
圖6?HT和GD疾病微環(huán)境T細胞和巨噬細胞的全局調(diào)控網(wǎng)絡
研究小結
本研究利用轉錄水平和代謝水平的測序數(shù)據(jù)聯(lián)合，在單細胞水平上鑒定了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達失調(diào)和代謝信號異常的免疫細胞；同時，構建了免疫細胞的全局調(diào)控網(wǎng)絡，為HT和GD疾病機制介導的免疫失調(diào)和代謝異常提供了新的視角。
參考文獻
Zheng,?Haitao?et?al.?“A?Global?Regulatory?Network?for?Dysregulated?Gene?Expression?and?Abnormal?Metabolic?Signaling?in?Immune?Cells?in?the?Microenvironment?of?Graves’?Disease?and?Hashimoto’s?Thyroiditis.”?Frontiers?in?immunology?vol.?13?879824.?26?May.?2022,?doi:10.3389/fimmu.2022.879824
]]>2月，單細胞測序技術繼續(xù)為腫瘤、疾病、發(fā)育、免疫等生物學問題的深入探索帶來新的突破。本期為大家介紹2月國內(nèi)學者借助單細胞測序技術在發(fā)育研究方面新的探索與發(fā)現(xiàn)，希望這些研究能為更多的科研工作者帶來關于利用前沿技術深入解析胚胎發(fā)育、干細胞分化等研究帶來思考和啟發(fā)。
2月1日，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院的研究團隊在《Cell?Mol?Gastroenterol?Hepatol》（IF=7.076）在線發(fā)表了題為“Notch調(diào)節(jié)的c-kit陽性肝竇內(nèi)皮細胞有助于肝臟分區(qū)和再生”的研究成果。該研究通過建立PHx小鼠模型誘導肝再生，并對肝竇內(nèi)皮細胞（SECs）?進行單細胞?RNA?測序，發(fā)現(xiàn)c-kit+SECs?通過Wnt2促進肝臟分區(qū)和再生，并受?Notch?信號調(diào)節(jié)。（DOI:10.1016/j.jcmgh.2022.01.019）
2月3日，中國科學院北京基因組研究所的研究團隊在《Genomics?Proteomics?Bioinformatics》（IF=7.051）發(fā)表了題為“單細胞轉錄組分析揭示間充質(zhì)干細胞的細胞異質(zhì)性”的研究成果。該研究通過對源自骨髓和沃頓氏膠的間充質(zhì)干細胞（MSC）?進行單細胞?RNA測序，繪制了這五個MSC亞群的發(fā)育軌跡，并確定了兩個在自我更新和免疫調(diào)節(jié)方面具有潛在功能的亞群。（DOI:10.1016/j.gpb.2022.01.005）
2月4日，南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院的研究團隊在《Front?Immunol》（IF=5.085）發(fā)表了題為“CCR2巨噬細胞促進正畸牙齒運動和牙槽骨重塑”的研究成果。該研究利用單細胞RNA測序研究牙槽骨重塑過程中巨噬細胞的轉錄組異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)機械力誘導的由?NF-κB通路介導的Ccr2巨噬細胞簇的功能轉變，導致促炎反應和骨重塑。（DOI:10.3389/fimmu.2022.835986）
2月4日，上海交通大學的研究團隊在《New?Phytol》（IF=8.512）發(fā)表了題為“水稻單細胞轉錄組圖譜定義了水稻小花和花序分生組織的發(fā)育軌跡”的研究成果。該研究使用單細胞?RNA?測序?qū)λ净ㄐ蜻M行分析，構建了涵蓋早期生殖發(fā)育過程中花序到小花轉變的基因組規(guī)模的基因表達資源，重建了小花和腋生分生組織的分化軌跡，鑒定了高度異質(zhì)性年輕花序中的離散細胞類型和調(diào)節(jié)因子組，并通過原位雜交和熒光標記線進行驗證。（DOI:10.1111/nph.18008）
2月8日，華中農(nóng)業(yè)大學的研究團隊在《Neuron》（IF=14.415）發(fā)表了題為“神經(jīng)源性神經(jīng)肽Y微調(diào)脾免疫反應”的研究成果。該研究通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)敲除大鼠腎上和腹腔神經(jīng)節(jié)（SrG-CG）中的?NPY?基因改變了脾淋巴細胞的增殖和活化，證明了NPY是一種用于神經(jīng)免疫系統(tǒng)串擾的古老語言，可用于緩解感染期間的炎癥風暴和調(diào)節(jié)自身免疫性疾病中的免疫平衡。（DOI:10.1016/j.neuron.2022.01.010）
2月15日，河南大學的研究團隊在《Plant?Cell》（IF=9.618）發(fā)表了題為“玉米單核轉錄組全面描述了控制草氣孔運動和發(fā)育的信號網(wǎng)絡”的研究成果。該研究開發(fā)了植物單核RNA測序平臺，并用它鑒定玉米表皮中成熟和發(fā)育氣孔的細胞，發(fā)現(xiàn)在氣孔發(fā)育和啞鈴形保衛(wèi)細胞形成中保衛(wèi)細胞和輔助細胞之間存在更復雜的關系，證實了已知特征并闡明了氣孔發(fā)育的關鍵參與者。（DOI:10.1093/plcell/koac047）
2月22日，南京大學醫(yī)學院的研究團隊在《Proc?Natl?Acad?Sci?USA》（IF=9.412）發(fā)表了題為“以單細胞分辨率破譯人類薄子宮內(nèi)膜的子宮內(nèi)膜生態(tài)位”的研究成果。該研究利用單細胞RNA測序表征人類子宮內(nèi)膜的細胞類型、它們的通訊以及增殖期正常和薄子宮內(nèi)膜中子宮內(nèi)膜生長的潛在機制，提供了對子宮內(nèi)膜再生和生長治療薄子宮內(nèi)膜的治療策略的見解。（DOI:10.1073/pnas.2115912119）
2月23日，中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所的研究團隊在《Adv?Sci》（IF=15.84）發(fā)表了題為“發(fā)現(xiàn)和應用對椎間盤穩(wěn)態(tài)和退化至關重要的產(chǎn)后髓核祖細胞”的研究成果。該研究對髓核（NP）進行單細胞RNA測序，構建了一個新的NP細胞圖譜，確定了具有再生潛力的常駐NP祖細胞，并揭示了椎間盤退變的有希望的診斷和治療靶點。（DOI:10.1002/advs.202104888）
2月24日，烏得勒支大學、香港中文大學-四川大學生殖醫(yī)學聯(lián)合實驗室的研究團隊在《Nat?Commun》（IF=12.121）發(fā)表了題為“人類腦室下區(qū)祖細胞的單細胞分析將?SFRP1?識別為重新激活祖細胞的目標”的研究成果。該研究分離出來自老年人腦室下區(qū)（SVZ）?的祖細胞進行單細胞RNA測序，據(jù)揭示了老年人SVZ?的祖細胞作為晚期少突膠質(zhì)細胞祖細胞的身份，將Wnt通路拮抗劑SFRP1確定為促進老年人SVZ祖細胞靜止的可能信號。（DOI:10.1038/s41467-022-28626-9）
2月25日，溫州醫(yī)科學大學的研究團隊在《Acta?Pharmacol?Sin》（IF=6.150）發(fā)表了題為“抗糖尿病藥物canagliflozin阻礙小鼠骨骼肌再生”的研究成果。研究通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)卡格列凈會損害固有的肌源性再生，并利用單細胞RNA測序揭示了LARS2通過影響線粒體結構和活性在調(diào)節(jié)成肌細胞分化和肌肉再生中發(fā)揮關鍵作用。該研究的單細胞RNA測序和分析由百邁客提供。（DOI:10.1038/s41401-022-00878-7）
2月24日，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學的研究團隊在《Genomics》（IF=6.205）發(fā)表了題為“單細胞測序揭示了絨山羊毛囊再生中真皮乳頭細胞的新存在形式”的研究成果。該研究對具有明顯毛囊周期性的絨山羊進行scRNA測序，構建了真皮乳頭細胞譜系分化軌跡，揭示了參與細胞命運決定的關鍵基因、信號和功能和毛囊再生的分子景觀。（DOI:10.1016/j.ygeno.2022.110316）
總?結
在發(fā)育方面，單細胞RNA測序和空間轉錄組學等新興技術正在為理解協(xié)調(diào)細胞命運決定的結構和組織模式的分子調(diào)控提供新的視角。從2月發(fā)表的文章可以看出，更多物種、更多器官的發(fā)育分化正在被解析。
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